一种新型融合蛋白、药物组合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及的是一种抑制肿瘤生长的新型融合蛋白及药 物组合物及该新型融合蛋白的制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 免疫逃逸是肿瘤的恶化进程中非常重要的一步。肿瘤细胞通过避免人体免疫系 统的杀伤作用得以快速生长，从而促进癌症的发生。T细胞表面重要的负调节分子ro-i、 CTLA-4和HM-3均能够抑制癌症发生过程中T细胞的免疫杀伤作用。目前，临床上已有针 对H)-l和CTLA-4靶点的药物，这些药物在临床上治疗效果非常显著。
[0003] 程序细胞死亡1 (PD-1)受体主要在激活的T细胞和B细胞中表达，其主要功能是 抑制免疫系统细胞的激活，这也是免疫系统一种正常的自稳机制，因过度的T/B细胞激活 会引起自身免疫病，所以ro-i是我们人体的一道护身符。在病理情况下，肿瘤微环境会诱 导浸润的T细胞高表达ro-i分子，肿瘤细胞会高表达ro-i的配体ro-Li和ro-L2,导致肿 瘤微环境中ro-i信号通路持续激活，t细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞，从而导致癌症 的产生。阻断这一信号通路的ro-i抗体可部分恢复t细胞的功能，使t细胞能够继续杀伤 肿瘤细胞。目前针对ro-l的抗体已有两个药物上市，分别是Nivolumab和Pembrolizumab， 二者在临床上对多种癌症均表现出显著的治疗效果。
[0004]VEGF-A是肿瘤细胞表达的一类促血管新生的生成因子，它的主要作用是提供免 疫抑制的微环境，为肿瘤细胞的增殖和癌症的发生创造有利条件。科学家MagaliTerme (MagaliT，ThibaultV，etal, 2015,J.Exp.Med. 212:139-148)研究发现VEGF-A营造 的肿瘤微环境能够引起CD8+T细胞表面H)-l分子的上调，从而引起CD8+T细胞的免疫杀伤 作用降低。同时发现VEGF-A的刺激能够引起HM-3,CTLA-4,LAG-3等抑制分子的表达。
[0005] 现有技术中已有利用VEGF-A抗体和H)-l抗体作用治疗肿瘤的报道，临床应用中 常常是单独使用其中一种抗体或同时使用两种抗体对肿瘤进行治疗，当同时采用上述两种 抗体进行治疗时则需要每天多次注射给药，不仅给操作者带来不便，而且给受试者也带来 更多痛苦。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中VEGF-Trap和H)-l抗体在临床应用中需要每 天多次注射给药的问题，提供既具有VEGF TRAP和H)-l抗体生理活性，又具有长效功能的 一种新型融合蛋白，并公开了该新型融合蛋白组成的药物组合物及该新型融合蛋白的制备 方法和用途。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 一种新型的融合蛋白，其结构通式如下： X-连接肽-Y-连接肽-IgGFc片段或Y-连接肽-X-连接肽-IgGFc片段； 其中，X为VEGF-Trap及其衍生物；Y为H)-l抗体片段及其衍生物或者H)-l拮抗剂片 段及其衍生物。
[0008] 本发明并不是简单的将两种抗体蛋白混合，而是采用两种抗体进行融合后组成一 种新型的融合蛋白，该蛋白能同时抑制H)-l和VEGF-A的活性，从而既能抑制肿瘤血管的新 生，又能双重抑制ro-1的产生和活性，多条途径激活t细胞；其具有既能饥饿肿瘤细胞，又 能激活T细胞杀伤肿瘤细胞的效果。
[0009] 本发明对单独使用ro-1抗体和VEGF-A抗体，组合使用ro-1抗体和VEGF-A抗体， 以及使用H)-l抗体和VEGF-A抗体结合的融合蛋白VNI的效果进行小鼠内肿瘤生长情况检 测，检测结果如表7和图3所示。通过表7可知：采用本发明的新型融合蛋白，其不仅仅能 同时具有两种抗体分别饥饿肿瘤细胞、以及激活T细胞杀伤肿瘤细胞的功能，而且还能达 到两种功能的协同促进作用，使抑制肿瘤生长的功能更加显著；并且，通过图3所示，采用 本发明的新型融合蛋白还具有有效延长各抗体单元生理活性功能效果的作用。
[0010] 优选地，所述连接肽为式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n所示的氨基酸序列，该n是 1~4的整数。所述X的氨基酸序列为SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :3,或其核苷酸编码序列 为SEQIDN0 :2 或SEQIDN0 :4。所述Y的氨基酸序列为SEQIDN0 :5 或SEQIDN0 :7， 或其核苷酸编码序列为SEQIDN0:6或SEQIDN0:8。所述IgGFc片段为IgGlFc片段、 IgG2Fc片段、IgG3Fc片段或IgG4Fc片段，其氨基酸序列分别为SEQIDN0:9、ll、13、15， 或其核苷酸编码序列分别为SEQIDNO:10、12、14、16。
[0011] -种制备新型融合蛋白的方法，将权利要求1-6任一项所述新型融合蛋白的编码 核苷酸序列插入表达载体中，并将此表达载体引入相应的表达系统进而进行融合蛋白的表 达。本发明融合蛋白的表达载体可以是重组真核表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体；也 可以是重组病毒表达载体，优选腺相关病毒或腺病毒载体。
[0012] 上述表达系统中融合蛋白的宿主细胞，可以为CH0细胞及其亚系或293细胞及其 亚系。
[0013] -种药物组合物，由权利要求1-6任一项所述的新型融合蛋白与药学上可接受的 载体或赋形剂组成。
[0014] 进一步，所述药物组合物的制剂形式为注射剂、注射用冻干粉针。
[0015] -种新型融合蛋白的用途，所述权利要求1-6任一项所述的新型融合蛋白用于肿 瘤的治疗；所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈 癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一 种或多种。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： 1、 本发明的融合蛋白不仅能同时具有两种抗体分别饥饿肿瘤细胞、以及激活T细胞杀 伤肿瘤细胞的功能，而且还能达到两种功能的协同促进作用，使抑制肿瘤生长的功能更加 显著； 2、 本发明的新型融合蛋白能有效延长各抗体单元生理活性功能效果，进而减少一个疗 程的总用药量，减少用药成本； 3、 本发明可有效减少注射给药的次数，减轻给药痛苦。
【附图说明】
[0017] 图1为VNI对HUVEC细胞增殖影响的EC50值曲线示意图。
[0018] 图2为VNI刺激PBMC产生IFNy的曲线示意图。
[0019] 图3为鼠源VNI在体内抑制肿瘤生长的对比情况示意图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0021] 实施例1蛋白制备 一种新型融合蛋白，其结构通式如下： X-连接肽-Y-连接肽-IgG Fc片段；其中，X为VEGF-Trap及其衍生物；Y为H)-l抗体 片段及其衍生物或者ro-i拮抗剂片段及其衍生物。
[0022] 本实施例中该X为VEGF-Trap，其核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示；Y为H)-l抗体 片段，其核苷酸序列如SEQIDN0 :6所示；所述连接肽为式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n所示 的氨基酸序列，该连接肽中n为3;IgGFc片段的核苷酸序列如SEQIDN0:16所示；S卩，本 实施例中合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQIDN0 :18所示。
[0023] 本实施例中上述新型融合蛋白的具体合成路线如下： 1.构建重组质粒 1. 1按照X-连接肽-Y-连接肽-IgGFc片段或Y-连接肽-X-连接肽-IgGFc片段的 通式，得到合成融合蛋白的基因片段和引物，并将合成融合蛋白的基因片段和引物重组至 质粒载体puc57中获得puc57-VNI质粒。该合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO :13所示，该基因和引物由专业公司北京金唯智公司合成。
[0024] 1. 2将puc57-VNI质粒和pCHOl. 0质粒分别进行双酶切处理，该酶切体系的建立： 在1.5mlEP管中加入如下成分：pCHOl.O质粒或puc57-VNI质粒40yl，Buffer4 10yl，AvrII和BstZ17I各5yl，灭菌水45yl，混匀后在37°C下反应5h，利用QIAGEN产 物纯化试剂盒回收，分别获得基因片段PCH01. 0和VNI。
[0025] 1. 3在T4连接酶的作用下，将已用相同酶切后回收获得的基因片段pCHOl. 0和 VNI基因片段连接；连接反应体系如下： 在 1.5mlEP管中加入如下成分 2yl的pCH01.0,6yl的VNI，10XT4Buffer1y1，1y1的T4DNA连接酶，混匀后在室温（20°C左右）下反应4h以上，连接产物转化至 ToplO大肠杆菌感受态细胞中，涂布于2YT(KANA)平板培养基上37°C静置过夜，平板编号 pCHOl. 0-VNIo
[0026] 1. 4从pCHOl.0-VNI平板中各挑取数个重组单菌落经过培养后做为PCR模板，分别 进行PCR筛选鉴定； 菌液PCR扩增反应体系（总体积20 y L) :2 X TaqHS10 y L、菌液模板2 y L、上下游引 物P1和P2各1 y L(终浓度0. 3 y mol/L)，最后用双蒸水补至20 y L;反应条件：95°C 2min， 一个循环；94°C 60s、53°C 60s、72°C 120s，30个循环；最后72°C 5min。通过琼脂糖凝胶电 泳分析结果，选取出具有目标产物的正确菌落。
[0027] 1. 5通过PCR筛选鉴定的菌落接种后提取再分别进行酶切鉴定；即首先进行重组 菌的质粒提取，然后进行酶切分析； 酶切体系：在1.5mlEP管中加入如下成分：质粒2yl，Bufferllyl，BSA0.lyl， AvrII和BstZ17I各1y1，补灭菌水至10y1，混匀后在37°C下反应4h。通过琼脂糖凝胶电 泳分析结果，选取出酶切鉴定正确的菌落。
[0028] 1. 6将通过菌落PCR和酶切鉴定正确的菌落随机接种数个菌落再进行测序鉴定， 选取出表达质粒保存备用。
[0029] 2.质粒转染及细胞筛选 采用宿主细胞CH0-S或DG44,按照FreedomCHO-SKit试剂盒说明书分别进行质粒转 染，转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养8h，摇瓶培养的条件为：37°C、8%C02、110rpm/min。通 过细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。
[0030] 转染48h后进行两步加压筛选：10P/100M，20P/200M(P=10yg/mLPuromycin，M=nM MTX) ;30P/500M，50P/1000M，获得初筛细胞。以有限稀释法进行单克隆细胞筛选，通过检测 蛋白表达量以及纯度从中优选克隆逐级扩大培养。
[0031] 3?蛋白表达和纯化 筛选高产克隆细胞从96孔板扩至24孔板生长，然后扩至6孔板生长，之后扩至50mL摇瓶生长。
[0032] 收集培养7天细胞培养上清液，离心除去细胞碎片，上清液以0. 45ym滤膜过 滤，调节口^1至7.4，用蛋白八琼脂糖亲和柱层析（11；[1'抑口？1'(^6；[11-六36口1^1'086 3€；1^11；^7 column)纯化融合蛋白，5倍柱床体积的去离子水冲洗柱子，再用5倍柱床体积