金黄色葡萄球菌taf融合蛋白制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白制 备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus)可引起人类多种感染，也是 奶牛乳房炎的一种重要致病菌。随着耐药菌株的大量出现和抗生素疗效渐失，疫苗免疫接 种成为预防S. aureus感染的最佳选择。金黄色葡萄球菌产生大量的致病因子，可以通过粘 附、免疫逃避以及产生侵袭性毒素和酶等因子致病，因此，有效的S. aureus疫苗应该是针 对同时阻断以上环节的多抗原疫苗。
[0003] 金黄色葡萄球菌FnBPA是重要的粘附分子，并具有良好的抗原性。Trap具有抗氧 化应激作用，并能诱导良好的免疫保护性作用。α -溶血素是S. aureus重要的外毒素，也是 引起肺炎的主要致病因子，具有良好的免疫原性。到目前为止，有关FnBPA、Trap和Hla融 合蛋白的免疫原性和免疫保护作用未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的是提供一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段及编码该优 势片段的基因。
[0005] 本发明的第二目的是提供含有上述金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段的融合 蛋白以及编码该融合蛋白的基因。
[0006] 本发明的第三目的是提供上述融合蛋白的制备方法。
[0007] 本发明的第四目的是提供上述融合蛋白的用途。
[0008] 本发明通过以下技术方案来实现：
[0009] 一、一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段，包括FnBPA蛋白N区域中301-430 位氨基酸和FnBPA蛋白rl-ΙΙ区域中FnBPArlO-Il的801-874位氨基酸两个片段，其氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0010] 进一步的，编码上述的免疫优势片段的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 进一步的，上述的金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段在制备金黄色葡萄球菌疫 苗中的应用。
[0012] 二、一种金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白，是由金黄色葡萄球菌的TRAP蛋白、α -溶 血素免疫优势片段和金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 4 所示。
[0013] 进一步的，编码上述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0014] 三、上述的融合蛋白的制备方法，包括用上述的基因克隆至原核细胞中进行异源 表达，并纯化该融合蛋白。
[0015] 四、上述的融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
[0016] 本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
[0017] 首先以金黄色葡萄球菌基因组为模板，通过PCR方法扩增获得FnBPA蛋白N区域 中301-430位氨基酸（FnBPA 301 43Qaa)的基因片段和FnBPA蛋白rl-ΙΙ区域中FnBPArlO-Il 的801-874位氨基酸（FnBPA801 S74aa)基因片段，然后用人工肽linker将FnBPA301 43_和 FnBPAiffll S74aa融合，命名为FL，并通过免疫保护作用研究，选择和确定了 FnBPA免疫优势区 (FL)。在此基础上，设计引物，通过重叠延伸PCR方法扩增获得Trap、HlaD和FL的融合基 因，并将该基因插入到表达载体pET-32a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后可获得高水平表达 的可溶性融合蛋白TAF。
[0018] 利用该融合蛋白N末端含有的6个连续His残基能与Ni2+柱结合的特性，选用 MagneHisTM蛋白纯化系统进行纯化，并将纯化后的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备疫苗免疫 小鼠，然后进行免疫原性和免疫保护作用研究。
[0019] 采用上述技术方案的积极效果：本发明的TAF融合蛋白制得的疫苗免疫小鼠后， 检测体液和细胞免疫应答水平，并进行攻毒，结果证实该融合蛋白疫苗具有较好的免疫保 护性效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具有更好的 免疫原性及免疫保护作用；另外，本发明的TAF融合蛋白不但进一步提高了抗金黄色葡萄 球菌感染的保护作用，而且简化了制备过程，在新型疫苗的开发应用方面具有重要的价值。
【附图说明】
[0020] 图 1 为 FnBPA301-430aa，FnBPA801-874aa、fl 的 PCR 产物电泳分析结果。其中，A 为 FnBPA301-430aa 的 PCR 产物，390bp ;B 为 FnBPA801-874aa 的 PCR 产物结果，222bp ;C 为 fl的PCR产物结果，657bp ;其中每个图中，M为DNA Marker DL5000 ;1为阴性对照；2为PCR 产物结果；
[0021] 图 2 为重组质粒 FnBPA301-430aa-pET32a、FnBPA801-874aa-pET32a 和 fl-pET32a 表达载体重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定结果。A图为FnBPA301-430aa-pET32a酶切鉴定 和PCR鉴定；B图为FnBPA801-874aa-pET32a酶切鉴定和PCR鉴定；C图为fl-pET32a酶切 鉴定和PCR鉴定。其中，每个图中的M为DNA Marker DL5000;1为重组质粒的鉴定结果；2 为重组质粒的酶切鉴定结果；
[0022] 图3为重组FnPBA301-430aa、FnBPA801-874aa和FL蛋白表达及纯化结果。图A 为FnBPA301-430aa ;图B为FnBPA801-874aa ;图C为FL。其中，每个图中的1为未诱导的 重组菌；2-6为IPTG分别诱导l-5h的重组菌；7为蛋白纯化结果；M为蛋白质Marker ;
[0023] 图4为重组蛋白FnBPA301-430aa、FnBPA801-874aa和FL免疫小鼠后攻毒结果（η =10)。其中，图A为实验动物S. aureus Newman株攻毒后存活数；图B为实验动物S. aureus Wood 46株攻毒后存活数；图C为实验动物S. aureus HLJ23-1株攻毒后存活数；
[0024] 图5为HlaD、Trap和fl的PCR产物电泳分析结果。其中A为HlaD的PCR产物， 459bp ;B 为 Trap 的 PCR 产物结果，498bp ;C 为 f 1 的 PCR 产物结果，657bp ;M 为 DNA Marker DL5000 ；
[0025] 图6为TAF基因 PCR扩增过程结果。其中，A为Trap+1 inker基因 PCR扩增产物； B 为 Linker+HlaD+linker 基因 PCR 扩增产物；C 为 Trap+linker+HlaD+linker 基因 PCR 扩 增产物；D 为 Linker+f 1 基因 PCR 扩增产物；E 为 Trap+Linker+HlaD+Linker+f I (TAF)基因 扩增产物；
[0026] 图 7 为重组质粒 Trap_pET32a、HlaD_pET32a、TAF_pET32a 双酶切鉴定结果；
[0027] 图8为重组蛋白Trap、HlaD、FL、TAF的SDS-PAGE分析结果。其中，1泳道为蛋白 分子量Marker ;2、6、10、14泳道为pET32a空载体对照；3-5泳道分别为重组蛋白FL诱导 前、诱导后及纯化后蛋白；49. IKD ;7-9泳道分别为重组蛋白HlaD诱导前、诱导后及纯化后 蛋白；36. 8KD ; 11-13泳道分别为Trap蛋白诱导前、诱导后及纯化后蛋白；38. 2KD ; 15-17泳 道分别为重组蛋白TAF诱导前、诱导后及纯化后蛋白；82. 4KD ;
[0028] 图9为肺部攻毒组免疫小鼠肺部细菌含量（Newman);
[0029] 图10为Trap-HlaD-FL(TAF)融合蛋白扩增方法。
【具体实施方式】
[0030] 本发明中生物材料的来源：
[0031] 1、金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株和HLJ23-1，金黄色葡 萄球菌凝集因子A的免疫原性，冯昊、刘乐峰、迟佳琦、王宁、李闰婷、佟春玉、马金柱、朱战 波、崔玉东，生物工程学报，2009, 25 (8) :1180-1186 ;另外，该生物专利还公开在专利"金 黄