抗凝融合蛋白ea及其应用

抗凝融合蛋白ea及其应用
【专利摘要】本发明公开了抗凝融合蛋白EA及其应用。本发明提供了融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。本发明的实验证明，Echistatin C端通过Linker(GGGG)串联AnnexinA5得到融合蛋白，该融合蛋白能够靶向定位结合活化血小板外翻的PS上，同时结合血小板膜上受体GPIIbIIIa,发挥抗血小板聚集和抗凝血的双重效果，协同作用达到较高的抗栓水平；且该融合蛋白在血栓形成过程中影响初级和次级凝血功能，可发挥抗栓功效，可广泛用于抗血栓性疾病的防治，为新药物开发提供参考。
【专利说明】
抗凝融合蛋白E A及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗凝融合蛋白EA及其应用。
【背景技术】
[0002] 在血管内面剥落处或修补处，血流变化，血小板沉积、白细胞聚集和凝血因子增多 等血液性质改变，导致血栓形成。血栓形成受遗传、环境多因素共同作用影响，一旦形成，往 往会引发血栓性疾病等不可逆后果。血栓性疾病有高发病率、致残率和致死率等特点，严重 危害人类生命健康。血栓的预防和治疗备受关注，抗栓药物的开发和使用仍是当今医学研 究热点。
[0003] 目前抗血栓药物(主)要有抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物三类，高效抗栓、减 少副作用是抗栓药物的发展目标。临床上双联或三联抗栓治疗有效结合抗血小板和抗凝双 重功效，实施个性化治疗、检测和评估，是当今研究和治疗的热门方向。AnnexinA5以钙离子 依赖方式结合PS，PS在凝血系统中是多种因子活化的必需因素;去整合素有抗血栓形成、抑 制肿瘤转移等多种生理功能。如何特异性发挥抗栓作用，合理设计融合蛋白是开发抗栓药 物的重要研究方向。
[0004] 血栓形成机制复杂，其中血小板和凝血系统是较重要的影响因素。初级止血形成 止血栓，血小板发挥主导作用;次级凝血中需要激活一系列的凝血因子和相关级联反应，形 成稳固的血凝块，凝血系统为主导。抗栓药物是否既拮抗血小板聚集，又干扰凝血系统，需 要一系列实验证明。

【发明内容】

[0005] 本发明的一个目的是提供抗凝融合蛋白EA。
[0006] 本发明提供的融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。
[0007] 上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5 蛋白的N端连接得到。
[0008] 上述融合蛋白中，所述连接肽为4个甘氨酸。
[0009] 上述融合蛋白为如下1)或2):
[0010] 1)序列表中序列2所不的蛋白质；
[0011] 2)将1)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。
[0012] 为了使（1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013] 表1标签的序列

[0015] 上述(2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端 连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 编码上述融合蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0017] 上述DNA分子是如下1)_3)中任一种的DNA分子：
[0018] 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[0019] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
[0020] 3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
[0021] 上述严格条件可为在6 X SSC、0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC、 0 · 1 % SDS和 1 X SSC、0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0022]含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的 范围。
[0023] 上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌 在抗血栓中的应用也是本发明保护的范围；
[0024] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌在抗血小板聚集中的应用也是本发明保护的范围；
[0025] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌在抗凝血中的应用也是本发明保护的范围；
[0026] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌在制备抗血栓产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0027] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌在制备抗血小板聚集产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0028] 或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌在制备抗凝血产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0029] 本发明另一个目的是提供一种具有如下1)-3)中至少一种功能的产品。
[0030] 本发明提供的产品，包括上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达 盒、转基因细胞系或重组菌；
[0031] 1)抗血栓；
[0032] 2)抗血小板聚集；
[0033] 3)抗凝血。
[0034]上述方法中，所述产品为药物。
[0035 ]上述抗凝血体现在融合蛋白EA延长血衆凝血时间，具体通过EA结合PS延长凝血时间；
[0036] 上述抗血小板聚集体现在抑制血小板聚集或者结合GPIIb/II la受体。
[0037] 本发明的实验证明，Echistatin C端通过Linker(GGGG)串联AnnexinA5得到融合 蛋白，该融合蛋白能够靶向定位结合活化血小板外翻的PS上，同时结合血小板膜上受体 GPIIbllla，发挥抗血小板聚集和抗凝血的双重效果，协同作用达到较高的抗栓水平;且该 融合蛋白在血栓形成过程中影响初级和次级凝血功能，可发挥抗栓功效，可广泛用于抗血 栓性疾病的防治，为新药物开发提供参考。
【附图说明】
[0038] 图1为Echistatin基因电泳图。
[0039] 图2为EA融合基因电泳图。
[0040] 图3为阳性克隆菌落PCR电泳检测。
[0041 ] 图4为不同IPTG浓度诱导GST-EA表达检测。
[0042] 图5为12 % SDS-PAGE鉴定GST-EA蛋白不同温度诱导表达。
[0043] 图6为GST-EA蛋白不同时间诱导表达。
[0044] 图7为亲和层析纯化GST-EA。
[0045] 图8为12%SDS-PAGE电泳检测PSP酶剪切目的蛋白的效率。
[0046] 图9为12%SDS-PAGE电泳鉴定得到的EA。
[0047] 图 10为EA蛋白western blot鉴定。
[0048] 图 11 为EA蛋白的 HPLC鉴定，其中，VWD:信号A，280nm，EA · dat。
[0049] 图12为EA蛋白与磷脂结合分析。
[0050]图13为EA蛋白与不同剂量PS结合活性分析。
[00511图14为Ca2+对EA蛋白与PS结合影响分析。
[0052] 图15为EA对血浆凝血时间的作用。
[0053] 图16为EA抑制血小板聚集率活性。
[0054] 图17为不同蛋白对血小板平均荧光强度的作用。
[0055] 图18为EA小鼠体内出血时间。
【具体实施方式】
[0056] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0057]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0058] pJETl. 2载体购自Thermo公司；小鼠抗AnnexinA5多克隆抗体由本实验室制备保 存;R⑶多肽由北京金盛生物公司合成;KM小鼠（罕）购自北京维通利华实验动物技术有限公 司；pJET1.2/blunt载体购自Thermo(赛默飞世尔科技中国有限公司）；pGEX-6P-l载体、 Sephacryl S200HR凝胶、GST亲和介质购自GE Healthcare公司；Phosphatidylcholine购自 北京利维宁生物技术有限公司；Coomassie Brilliant Blue G-250、R-250、Goldview、 Glycine、TEMED、Amp、IPTG、TMB、DAB、脱脂奶粉、HRP-山羊抗小鼠 IgG二抗、ADP·Na2等购自 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；凝血酶、牛血纤维蛋白原购自北京中生泰瑞科技有限公 司; FITC-羊抗人纤维蛋白原购自北京诺博莱德科技有限公司。
[0059]下述实施例中部分试剂如下：
[0060] TM 表达培养基（800mL): Iryptofte 9.6：g Yeast Extract 19.2g
[0061 ] NaCl 8. Og 50%甘油 9. 6mL 11 Tris 溶液 7. 44mL
[0062] 用蒸馏水溶解定容至80〇111匕121°(：高压灭菌20min，冷却。
[0063] 1\卩85缓冲液（1〇: NaCl 8. Og K(； 1 0.?
[0064] KH,P04 0.24g Na,HP04 · 12Ε? 2. 9g
[0065] 用900mL蒸馏水溶解，浓HC1调节pH至7.4，定容至11^，真空抽滤除杂。
[0066] 10mM GSH(lOOmL):0.3g的还原性谷胱甘肽溶于100mL的1 XPBS缓冲液，小量分 装，-20 °C保存。
[0067] PSP酶储存液（100mL): NaCl 0.88g EDTA 0,03g
[0068] DTt 0.08g 甘妯 50mL
[0069] 用25mM的Tris-HCl(pH8.0)溶解，定容至100mL，小量分装，-20°C保存。
[0070] 50mg/mL氨苄青霉素（30mL):称取1.5g氨苄青霉素溶解于30mL的无菌蒸馏水，用 0.22μΜ的滤膜过滤除杂，小量分装-20°C保存。
[0071] 0.1M IPTG(30mL):称取0.715g IPIG溶解于30mL的无菌蒸馏水，用0.22μΜ的滤膜 过滤除杂，小量分装-20 °C保存。
[0072] R250染色液（1L):
[0073] R250 l.Og
[0074] 无水乙醇 420mL
[0075] 冰乙酸 100mL
[0076] 蒸馏水溶解定容至1L，棕色瓶室温避光保存。
[0077] G250染色液（500mL):50mg的Brilliant Blue G-250溶于25mL的95%乙醇，加50mL 磷酸溶液，用蒸馏水充分搅拌溶解，定容至500mL，避光过滤。
[0078]脱色液（1L):
[0079] 冰乙酸 50mL
[0080] 无水乙醇 450mL [0081 ]蒸馏水 500mL
[0082] 转膜缓冲液（500mL): 甘氨酸 L 45g Tris： 2 .9? g
[0083] $：DS 0,185g 甲醇 iOOffiL
[0084] 用蒸馏水定容至500mL，冰浴放置，现用现配。
[0085]洗膜缓冲液/TBST( 1L):
[0086] NaCl 5.84g
[0087] Tris 1.21g
[0088] 用800mL蒸馏水溶解，调节pH值为7 · 5，加0 · 5mL的Tween-20，定容至1L。
[0089] TBS(IL)：
[0090] Tris 2.42g
[0091] NaCl 8.8g
[0092] 用900mL蒸馏水溶解，调节pH值至7.4，定容至1匕
[0093] Binding Buffer:含2%脱脂奶粉，5mMCaCl2的TBS溶液，现用现配。
[0094] Washing buffer:含0.05 % Tween-20，2mMCaCl2 的 TBS 溶液。
[0095] ELISA 显色液：
[0096] A:乙酸钠2.72g，柠檬酸钠0.32g，30%H202 60yL，蒸馏水定容至100mL。
[0097] 8:柠檬酸钠0.198 40了六.他2 0.048，了]\?0.038，甘油1011^，蒸馏水溶解定容至 100mL；
[0098] 显色前将A液和B液等体积混合。
[0099] 纤维蛋白原溶液：用20mL的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(PH7.4)溶解100mg纤维蛋 白原，配置成〇. 5 %纤维蛋白原溶液(现配现用）。
[0100] 凝血酶:用质量百分含量0.9%生理盐水配置成40U/mL凝血酶溶液(现配现用）。 [0101] 肝素钠溶液:生理盐水配置成200U/mL肝素钠注射液。
[0102] ADP诱导剂：用生理盐水配置成300ymol/L ADP · Na2溶液。
[0103] RGD多肽:GA-10，序列：GCGRGDWPCA，分子量：1019 · 20Da。
[0104] 实施例1、EA融合蛋白的获得
[0105] EA融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通过Linker(GGGG)与AnnexinA5蛋白的N端连 接，得到融合蛋白。
[0106] EA融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2,其编码基因的核苷酸序列为序列表 中序列1。
[0107] 序列2第1-77位氨基酸为Echistatin蛋白，序列2第82-400位氨基酸为AnnexinA5 蛋白。
[0108] 序列1第1-231位核苷酸为Echistatin蛋白编码基因，序列1第244-1200位核苷酸 为AnnexinA5蛋白编码基因。
[0109] -、表达EA融合蛋白基因的载体的构建 [0110] 1、自行构建获得Echistatin基因
[0111] 以如下表2中的E1F和E1R作为模板，E2F和E2R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物。
[0112] 将上述PCR产物电泳，结果如图1所示，M.DNA marker; l_3.Echistatin基因，可以 看出，得到231bpPCR产物。将上述PCR产物送去测序，该PCR产物为序列表中序列1第1-243位 所示的Echistatin基因。
[0113] 表2引物序列
[0116] 2、EA融合蛋白基因的构建
[0117] 表3
[0119] 单下划线的分别是BamHI和Xhol的识别位点，双下滑线为互补片段4个甘氨酸序 列。
[0120] 分别以上述Echistatin基因和pGEX-6P-l_AnnexinA5质粒为模板，用表4所示的引 物或体系分别进行PCR。
[0121] 表4
[0123] PCR 反应程序:95°C 预变性 5min;95°C 变性 lmin，56°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min(循 环30次）；72°C延伸10min;4°C保存。
[0124] 体系1和2分别得到Echistatin-L(经过测序，其核苷酸序列为序列1第1-243位，其 中232-243为连接肽的编码DNA分子)和L-AnnexinA5基因（经过测序，其核苷酸序列为序列1 第232-1203位，其中232-243为连接肽的编码DNA分子）。
[0125] 以Echistatin-L和L-AnnexinA5基因为模板，以E3F、LAA-3分别为上、下游引物，进 行PCR，得到 1226bp的PCR产物（图 2，M. DNAmarker; 1 -4为EA基因）。
[0126] 将1226bp的PCR产物送去测序，其核苷酸序列为序列表中序列1，将该PCR产物命名 为EA基因。
[0127] 3、表达EA基因的重组载体的获得
[0128] 将上述获得的序列1所示的EA基因替换表达载体PGEX-6P-1(GE Healthcare公司， 产品目录号Code no. 28-9546-48)的BamHI和Xhol之间的片段，得到表达EA基因的重组载 体，命名为PGEX-6P-1 -EA，EA基因与载体上的GST标签融合表达。
[0129] 二、EA融合蛋白的表达
[0130] 1、表达EA融合蛋白基因的重组菌的构建
[0131] 将上述重组载体pGEX-6P-1-EA转入BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-卜EA〇
[0132] 菌液PCR鉴定，引物为E3F、LAA-3，结果如图3所示，M. DNA marker; 1-2，特异性较好 的PCR电泳;得到1226bp为阳性菌。
[0133] 对照:将pGEX-6P-l转入BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-l。
[0134] 2、EA融合蛋白的表达条件摸索
[0135] 1)最适IPTG浓度的摸索
[0136] 将重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA的单菌落至5mL LB液体培养基(Amp浓度为50μ g/mL)，37°C，190rpm培养过夜，得到菌液。以重组菌BL21 (DE3)/pGEX-6P-l为对照。
[0137] 将菌液按1:100的比例加入100mL的TM表达培养基中，37°C扩培3.5h左右达到对数 期，0D 6qq为0 · 6-0 · 8之间，加入IPTG(终浓度设定为:0、25、50、100、150、200、300ymo 1/L)后， 在25°C，190rpm诱导12h。在4°C，6000rpm离心15min收集菌沉。菌沉用20mL 1 XPBS溶解。在 等功率破碎相同的时间，4°C，12000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测在 不同温度下，目的蛋白的表达情况。
[0138] 结果如图4所示，M.Protein marker(上样量5ul) ;l.BL21(DE3)/pGEX-6P-l未加 IPTG诱导表达情况;2 · BL21 (DE3)/pGEX-6P-l加 100μΜ IPTG诱导表达情况;3-9 · BL21 (DE3)/ PGEX-6P-1-EA 加 IPTG 终浓度为(^]?、25以]\1、5(^]\1、10(^]\1、15(^]\1、20(^]\1、30(^]\1诱导表达情况； 可以看出，与BL21 (DE3) /pGEX-6P-1 相比，BL21 (DE3) /pGEX-6P-1 -EA66kD加入IPTG有明显的 70kD目的蛋白条带，为EA与载体上GST融合表达得到的重组蛋白GST-EA。
[0139] 且在IPTG为100μΜ时，蛋白表达量较高，且不随IPTG浓度提高而增多。IPTG浓度过 高易形成包涵体，并且IPTG对细胞有一定的毒性。因此，经实验探索得知IPTG诱导浓度为 100μΜ〇
[0140] 2)最适表达温度的摸索
[0141] 将BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA菌液按1:100的比例加入100mL的ΤΜ表达培养基中，37 °C扩培3.5h左右达到对数期，0D6QQ为0.6-0.8之间，加入IPTG(终浓度为100μπιο1/υ后，分别 在37°C、30°C、25°C，190rpm诱导 12h。在4°C，6000rpm离心 15min收集菌沉。菌沉用20mL 1 X PBS溶解。在等功率破碎相同的时间，4°C，12000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测在不同温度下，目的蛋白的表达情况。
[0142] 结果如图5所示，1 -3，37°C诱导的全蛋白、上清、包涵体;4-6，30°C诱导的全蛋白、 上清、包涵体;7-9，25°C诱导的全蛋白、上清、包涵体;可以看出，由图可见，在37°C、30°C、25 °C温度下诱导，目的蛋白均能大量表达，且在上清和包涵体中都存在。为方便诱导和纯化， 避免包涵体错误折叠降低活性，后期大量诱导选择25°C度诱导，收集上清液进行下一步的 纯化与性质研究。
[0143] (3)最适诱导时间的摸索
[0144] BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA在最适的温度25°C和100μΜ IPTG浓度下，诱导时间设定 为Oh、5h、6h、7h、8h、9h、1 Oh、1 lh、12h、20h，其他条件相同，SDS-PAGE检测蛋白随时间积累情 况。
[0145] 结果如图 6 所示，1-10.加入 IPTG 诱导诎、511、611、711、811、911、1011、1111、1211、2011全蛋 白表达情况，由图可见，加入诱导剂后随时间的延长，目的蛋白逐渐增多，在llh-12h时蛋白 积累量达到最大，在诱导20h全蛋白目的蛋白量有部分减少，推测是由于诱导时间过长，蛋 白被降解，或是在营养物大量消耗后部分蛋白被大肠杆菌消耗。因此，后期大量表达时间应 在12h左右。
[0146] 3、融合蛋白EA的纯化
[0147] 1)破菌
[0148] 收集BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA在最适的温度25°C和100μΜ IPTG浓度下诱导12h的 菌液，4°C，6000rpm离心20min，收集菌沉。称取适量菌沉，按照每克菌沉15mLl XPBS的比例 充分溶解菌沉，冰浴，超声破碎悬液，功率600W，工作3s，间歇27s，共20min(40次循环），避免 产生泡沫;4°C，12000rpm离心20min，收集上清液。
[0149] 2)GST亲和层析纯化
[0150] (1)装柱和平衡:将亲和介质加入到层析柱中，自然沉降。用40mL的1 XPBS平衡层 析柱，流速为lmL/min，调节紫外检测仪示数至零。
[0151] (2)上样和洗涤:上述1)得到的上清液，用0.45μπι的针头过滤器过滤。上样流速为 O.SmL/miruPBS洗涤，流速为lmL/min，直至紫外检测仪示数降至基线。
[0152] (3)洗脱:用10mM的还原性谷胱甘肽溶液洗脱目的蛋白GST-EA，流速为0.5mL/min， 紫外检测仪示数上升出现峰值，收集蛋白。
[0153] (4)蛋白浓缩、除盐:将蛋白加入到30KD的超滤管，4°C，3000g离心10min，除去部分 还原性谷胱甘肽，PBS稀释浓缩液，再次超滤。
[0154] (5)柱子再生和保存：用2倍介质体积的0.5M NaOH溶液洗柱子，除去非特异性吸附 的杂质，用ddH20洗至中性，用4倍介质体积的20 %乙醇洗涤，4 °C保存。
[0155] (6)SDS_PAGE 检测。
[0156] 结果如图7所示，1.25 °C诱导表达上清液;2.穿透液;3-4.洗脱得到的GST-EA，可以 看出，将破碎后上清液稀释后上样到GST亲和柱，减缓流速，穿透液中目的蛋白较少，GST亲 和柱效高;GSH洗脱出的蛋白纯度与产量较好，目的蛋白GST-EA纯度为92%。
[0157] 3)PSP酶切除重组蛋白GST-EA的GST标签
[0158] 用GST亲和层析纯化得到的GST-EA，使用PSP酶（南通表源生物技术有限公司， 1000Units/mg)分别按照摩尔比例为800:1，400:1，200:1，100:1，50:1，10:1，3:1混匀（裂解 buffer:0.5mol/L Tris-HCl+150mM Nacl+0.1%Triton-100，pH 8·0)，4Γ，酶切 12h〇
[0159] SDS-PAGE检测不同比例的酶切效果，结果如图8所示，1-8. PSP酶切效果(融合蛋白 与PSP酶的摩尔数比分别为800、400、300、200、100、50、10、3;9.重组蛋白631^六对照，可以 看出，在重组蛋白GST-EA与PSP酶的摩尔数比为800酶切12h，可将重组蛋白GST-EA充分切 开，证明PSP酶活性较强。8泳道中出现三个蛋白条带，由上至下分别为PSP酶（46kD)、EA (44kD)、GST标签(26kD)。9泳道中较粗条带为GST-EA(70kD)，该融合蛋白出现一定程度的标 签脱落。
[0160] 将GST-EA与PSP酶按照摩尔比例为800:1酶切得到的溶液样品过GST亲和层析柱， PBS洗涤，收集穿透峰，浓缩脱盐，得到洗脱液。
[0161 ] 洗脱液进行SDS-PAGE电泳结果如图9所示，M.Protein marker; 1-2·ΕΑ，可以看出， 得到大小为44kD的目的融合蛋白ΕΑ。
[0162 ]融合蛋白ΕΑ的氨基酸序列为序列2。
[0163] 4、融合蛋白ΕΑ的验证
[0164] l)Western blot验证
[0165] 将纯化的AnnexinA5蛋白（按照文献的方法制备AnnexinA5蛋白：梁盼盼，张鑫蕊， 井健.人Annexin A5的表达及性质研究.北京师范大学学报（自然科学版），2009,45(4): 378-380. AnnexinA5蛋白编码基因的核苷酸序列为序列1的第231-1203位）、上述3得到的融 合蛋白EA上样进行Western blot检测，一抗为AnnexinA5多克隆抗体，二抗为HRP-山羊抗小 鼠抗体。
[0166] 结果如图10所示，1.阳性对照AnnexinA5; 2.融合蛋白EA，可以看出，融合蛋白EA条 带略高于阳性对照条带，目的蛋白条带对比marker位置，与蛋白分子量一致。
[0167] 2)分子筛(SEC-HPLC)鉴定
[0168] (1)准备：超纯水、平衡液（1 X PBS)、200yL上述3得到的融合蛋白EA、10 %甲醇经 0.22μΜ的针形滤膜过滤。
[0169] (2)开机：打开四元栗、检测器等进入自检，设定参数v = 5mL/min，水洗约2个 Sephacry 1 S200凝胶柱体积，排除气泡。
[0170] (3)平衡:用平衡液1 XPBS平衡体系约2个柱体积直至基线平稳。
[0171] (4)上样:上样200yL上述3得到的融合蛋白EA，1个柱体积的平衡液进样。
[0172] (5)结束:分别用超纯水和10%甲醇清洗管道和柱子，输出图谱，分析。
[0173] 结果如图11所示，图谱显示在保留时间8. 150-9.093min检测到EA蛋白，在 8.513min达到峰值，与HPLC测定的蛋白分子量44kD峰值参数出现时间一致，峰型对称性较 好，目的蛋白EA含量的面积百分比达到92.852%，蛋白以单体形态稳定存在。
[0174] 实施例2、融合蛋白EA的功能研究
[0175] -、EA脂质结合活性分析
[0176] 1、EA的磷脂结合分析
[0?77] (1)分别称取10mg PS(磷脂酰丝氨酸，phosphatidylserine，购自北京华迈科生物 技术有限公司）和PC(磷脂酰胆碱，phosphatidyl choline，购自北京利维宁生物科技有限公 司）溶解于10mL氯仿中，向每个酶标孔中加入2.5yg，放于通风橱中待溶剂挥发完全，磷脂吸 附到聚苯乙烯表面上。
[0178] (2)封闭：每孔中加入100yL TBS配置5% (w/v)脱脂奶粉的封闭液，封口膜封板，37 °C封闭2h。弃去封闭液，每孔加入200yLwashing buffer，静置3min弃去，重复3次。充分除净 液体。
[0179] (3)Binding buffer将实施例1的纯化的融合蛋白EA和AnnexinA5蛋白稀释不同浓 度，向每孔加入50yL蛋白样品，37°C温育2h，washing buffer洗涤3次，方法同上。
[0180] (4)孵一抗:binding buffer以1:10000比例稀释一抗（小鼠抗AnnexinA5多克隆抗 体），每孔加 l〇〇yL，37°C孵育lh，washing buffer洗涤3次。
[0181 ] (5)孵二抗:binding buffer以1:5000比例稀释二抗(HRP-山羊抗鼠 IgG抗体），每 孔加100yL，37°C孵育lh，washing buffer洗涤6次，ddH20洗涤3次，用滤纸吸干水分。
[0182] (6)显色:将TMB显色液A、B等体积混合，每孔加入140yL，暗处反应10min，此时呈现 不同程度的蓝色。
[0183] (7)终止反应:每孔加入40yL 2mol/LH2S〇4,反应孔中蓝色变为黄色，稳定5min。
[0184] (8)用酶标仪450nm处测定各孔的吸光度。
[0185] 该Elisa过程是磷脂吸附-AnnexinA5包被-AnnexinA5小鼠源抗体特异结合-HRP标 记山羊抗小鼠抗体孵育-TMB应用液显色生成有色产物，在λ = 450ηπι测定吸光值，AnnexinA5 与磷脂结合活性越强，吸光值越高。磷脂(PS或PC)吸附在酶标板上，AnnexinA5分子与不同 磷脂结合能力不同，AnnexinA5包被磷脂程度成剂量依赖关系。
[0186] 结果如图12所示，可以看出，AnnexinA5与PS结合活性随着蛋白浓度的升高而增 强;AnnexinA5不与PC结合。与AnnexinA5相比，EA蛋白磷脂结合性质与趋势没有明显区别， 说明Echistatin没有遮挡AnnexinA5与PS作用位点。AnnexinA5浓度为50yg/mL时，与2 · 5yg PS结合已趋向饱和。
[0187] 2、磷脂剂量与磷脂结合分析
[0188] 各孔中 EA 为 50yL，50yg/mL。将 PS 的剂量设定为 0yg、0.4yg、0.8yg、1.2yg、1.6yg、 2.(^8、2.448、2.848、3.2以8，其他步骤同上述1。
[0189] 结果如图13所示，由图可见，不同剂量PS固定在酶标板上，EA与PS结合呈现出剂量 依赖关系，在PS>2.5yg，蛋白与PS结合逐步达到饱和。
[0190] 3、钙离子浓度与磷脂结合分析
[0191] 各孔中EA为50yL，20yg/mL，PS剂量为2.5yg，binding buffer中Ca2+浓度设定为 OmM、0 · 0 ImM、0 · 05mM、0 · ImM、0 · 5mM、1 · OmM、3mM、5mM、1 OmM、20mM、50mM、1 OOmM。其他步骤同 上。
[0192] 结果如图14所示，AnnexinA5是钙离子依赖磷脂结合蛋白，Ca2+存在时与带负电荷 的PS可逆性结合，在Ca 2+浓度为0.5-10mM之间，EA与PS结合活性随Ca2+浓度增高而提升。
[0193] 二、EA对血浆凝血时间影响分析
[0194] (1)向每个酶标孔中加入2.5yg PS(氯仿为溶剂），置于通风橱中挥发溶剂。
[0195] (2)每孔中加 100yL的5%脱脂奶粉(TBS配制），37°C封闭2h，washing buffer洗涤3 次。
[0196] (3)用binding buffer稀释EA为不同浓度，每孔加50yL蛋白稀释液，37°C孵育2h， washing buffer洗涤3次。
[0197] (4)制备50%血浆(？83为溶剂），每孔加入10(^1^，37°(：孵育31^11。每孔加入2541^ 0.08M CaCl2(Ca2+终浓度为16mM)，即时血浆开始凝固，设定波长为405nm，平均每5min检测 各孔吸光度。
[0198] 本实验用1:9枸橼酸钠抗凝血浆。向去Ca2+的抗凝血浆中重新加入Ca2+(CaCl 2溶 液），血液发生凝固。从加入Ca2+至血浆凝固这一过程经历的时间为血浆凝固时间，Ca 2+、磷 脂与活化的凝血因子VIII结合形成复合物，后者激活凝血因子XXa2+、磷脂、凝血因子V存在 时，活化的凝血因子X与之共同作用，将凝血酶原激活转化为凝血酶，凝血酶将纤维蛋白原 转化为纤维蛋白，达到血浆凝固的效果。
[0199] 结果如图15所示，用酶标仪检测不同血浆样品的浊度动态变化。随着EA浓度增加， 血浆凝固时间出现明显的延长，血浆在405nm吸光度在同时间点明显降低，血浆浊度较低。 EA与PS结合，阻止PS参与血浆中的凝血因子X活化，从而达到延长RT、减少纤维蛋白产量、降 低血浆浊度的效果。
[0200] 三、抗血小板聚集活性分析
[0201] EA蛋白是去整合素 Echistatin与AnnexinA5通过Linker连接的融合蛋白， Echistatin是含有R⑶序列的凝血抑制物，R⑶序列可识别并特异性结合血小板GPIIb/IIIa 受体，AnnexinA5能够结合血小板活化后外翻的PS。
[0202] (1)准备工作:将三种具有抗血小板聚集的蛋白（EA蛋白、R⑶序列、AnnexinA5)稀 释成不同浓度;开机机器自检，进入ADP聚集实验界面。
[0203] (2)用蓝色1:9枸橼酸钠抗凝管收集人全血，摇匀后800rpm离心8min，黄色上清液 为富血小板血浆(PRP)，取出PRP，管中剩余液体3000rpm离心10min，上清液为贫血小板血浆 (PPP)〇
[0204] ⑶将300μ1的PPP加入测试杯中，放到测试通道中按"PPP"键调零。
[0205] (4)将300μ1的PRP加入测试杯中，加入测试棒，放置在左侧预温面板区域进行预 温。放入调零的同一通道，按下该通道的预温键，界面显示时间开始从60s减少，至13-15S， 加入lOylADP(终浓度为10μΜ)同时按下绿色按钮，开始测试，3min出现空白组血浆的最大聚 集率。
[0206] (5)以同种方法测试给药组血浆，将300ylPRP与30μ1的蛋白样品在EP管混匀，取 300μ1给药组血衆加入到测试杯，步骤同上。蛋白样品有四种不同浓度的EA、AnneixnA5、RGD 多肽(序列为GCGRGDWPCA，M=1019.20Da)。
[0207] (6)蛋白对ADP诱导的血小板聚集的抑制率公式为：
[0209]结果如图16所示，图中可见，随着三种蛋白药物浓度增加，ADP诱导血小板聚集的 抑制率增强；EA效果最好，EA的IC50 = 4ymol/L，在ΙΟμ mol/L时抑制率高达90%，呈现出 AnnexinA5、RGD序列、去整合素在抑制血小板聚集的协同效应。
[0210]四、凝血四项的测定
[0211 ]用蓝色1:9枸橡酸钠抗凝管收集人全血，摇勾，3000rpm离心10min，取上层贫血小 板血浆(PPP)。在每个测定杯子中加入300yL的PPP和30yL的蛋白样品（PBS为对照）混匀，37 °C孵育1 Omin，全自动凝血分析仪测定结果。
[0212] 结果如下表5所示，
[0213] 表5. EA对血浆凝血四项的作用
[0215] 在凝血四项检测中EA随着蛋白浓度的增高能够明显延长APTT，超过正常参考值， 而PT变化幅度不大，FIB、TT值没有临床意义的改变。APTT是评价内源性凝血系统状况，如凝 血因子XII、XI、IX、X，以上凝血因子的减少会引起APTT的延长。推测EA能够结合Ca 2+、磷脂， 使X因子不能充分活化，影响内源凝血途径，进而会影响共同凝血途径。
[0216] 五、EA对GPIIb/IIIa受体亲和性分析
[0217] (1)用枸橡酸钠抗凝管收集人全血lml混勾，取血4h内以室温条件800rpm离心 8min，上清液为富血小板血浆(PRP)。
[0218] (2)按照以下表6依次加样：
[0219]表6
[0221 ]将管中液体轻轻混匀，终体积为50μ1，室温下孵育lOmin。其中用来激活血小板的 ADP终浓度为2ymol/L。
[0222] RGD序列为GCGRGDWPCA，分子量为1019.20Da，含有与GPIIb/IIIa受体特异性识别 结合的RGD序列。
[0223] (3)固定:在各管中加入450μ1的4%多聚甲醛，室温固定45min。
[0224] (4)荧光抗体标记:在各管分别加入5μ1 FITC标记的羊抗人纤维蛋白原抗体，在37 °C 孵育 30min。
[0225] (5)流式细胞术检测:设定激发波长为488nm，检测荧光强度。
[0226] 本实验中FITC标记的纤维蛋白原可结合GPIIb/IIIa受体，使血小板标记上FITC荧 光。EA含R⑶序列，R⑶可与纤维蛋白原竞争结合GPIIb/II la受体，理论上来说，EA蛋白浓度 越高，R⑶序列含量越高，结合GPIIb/IIIa受体能力越强，流式细胞术检测到血小板的荧光 强度减弱会越明显。
[0227] 结果如图 17所示，1-5.加入PBS，10yMRGD多肽，20μΜ ΕΑ，10μΜ ΕΑ，5μΜ EA选定血小 板与荧光信号图；6.1-5荧光强度叠加图；7.1-5荧光强度值;血小板被2ymol/L的ADP激活， GPIIb/IIIa受体能够结合纤维蛋白原，在血小板粘附、聚集过程中发挥重要作用。实验结果 表明，ΙΟμΜ R⑶肽（阳性对照）和EA蛋白在一定程度上能够减弱血小板的平均荧光强度；随 着蛋白浓度增高，平均荧光强度有减弱趋势。ΕΑ融合蛋白中RGD序列没有被蛋白分子结构所 遮挡，可以被相关受体特异识别结合。
[0228] 六、ΕΑ在小鼠体内出血风险评估
[0229] 运用小鼠尾部横截模型评价体内出血风险。昆明小白鼠，雌性，24_26g，5周龄。腹 腔注射1%戊巴比妥钠0.1ml进行麻醉，眼球后静脉丛注射给药。
[0230] EA实验组为不同浓度的EA溶液(溶质为EA，溶剂为生理盐水），剂量分别为0.01 μ mol/kg、0·039ymol/kg、0·187ymol/kg;
[0231] 阴性对照组为同体积的生理盐水；
[0232] 阳性对照组为肝素钠溶液(Heparin)，剂量为200U/kg;
[0233] 单独A5组为不同浓度的AnnexinA5溶液(溶质为EA，溶剂为生理盐水），剂量分别为 0·038ymol/kg、0·085ymol/kg、0·2ymol/kg。
[0234] 注射给药20min后，距尾端6mm处横截，立即将出血尾部放置入37 °C生理盐水中浸 泡观察出血状况，记录出血至停止出血的时间。
[0235] 将EA设置为不同浓度，采用鼠尾横截模型记录小鼠体内出血时间，进而评估不同 浓度蛋白的出血风险。
[0236] 结果如图18所示，*是与生理盐水组对比差异显著(P〈0.05)，#是与肝素组对比差 异显著(P〈0.05)。实验中，与生理盐水组对比，EA实验组出血时间差异显著；当给药浓度增 大3.9倍，出血时间长于肝素组(20(^111〇1/1^)，且差异显著。
[0237] 单独A5组0.038ymol/kg剂量的出血时间为193s、0.085ymol/kg剂量的出血时间为 289s、0.2ymol/kg剂量的出血时间为1142s。
[0238] 相比较单独的Annexin A5，EA的体内出血时间明显延长，表明EA的体内活性强于 单独的Annexin A5。
[0239]当提高EA浓度，随着蛋白浓度的增高，出血时间明显延长，出血风险增加。为保证 体内用药的安全低风险性，建议低浓度用药。
【主权项】
1. 融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C 端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。3. 根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于:所述连接肽为4个甘氨酸。4. 根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白为如下1)或2): 1) 序列表中序列2所不的蛋白质； 2) 将1)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。5. 编码权利要求1-4中任一所述融合蛋白的DNA分子。6. 如权利要求5所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下1)_3)中任一种的DNA 分子： 1) 编码区为序列表中序列1所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子； 3) 与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至 少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99% 同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。7. 含有权利要求5或6所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。8. 权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要 求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血栓中的应用； 或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要 求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血小板聚集中的应用;或，权利要 求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组 载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗凝血中的应用； 或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要 求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血栓产品中的应用； 或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要 求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血小板聚集产品中的应用； 或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要 求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗凝血产品中的应用。9. 一种具有如下1)_3)中至少一种功能的产品，包括权利要求权利要求1 -4中任一所述 融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞 系或重组菌； 1) 抗血栓； 2) 抗血小板聚集； 3) 抗凝血。10. 根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述产品为药 物。
【文档编号】A61K38/16GK105949326SQ201610542954
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】井健
【申请人】北京师范大学