2a进行连接转化培养，提取单菌落，扩增培养提取质粒，质粒用 BanmH I和Hind III酶切验证，在1%凝胶电泳分析，出现预期大小的目的条带，载体大小 为5900bp，如图7所示。
[0087] 取鉴定正确的质粒转化到表达菌Rosetta(DE3)，在Amp+抗性LB培养基中培养 至0D6000. 4~0. 6后，加入IPTG至终浓度ImM，取诱导前及诱导后5h菌液，处理后进 行SDS-PAGE验证。通过镍柱纯化方法纯化目的蛋白，SDS-PAGE进行分析，结果显示在 49. IKD(FL)、36. 8KD(HlaD)、38. 2KD(Trap)、82. 4KD(TAF)出现条带与预期大小相同，如图 8 所示。蛋白分子量Marker红色条带大小为72KD。
[0088] 实施例3
[0089] 本实施例说明TAF、Trap、HlaD和FL蛋白免疫效果对比。
[0090] 1、动物免疫和攻毒试验
[0091] 取健康、雌性、相同周龄的SPF级ICR小鼠180只，分为腹腔组和肺部组。其中腹 腔组分为Trap实验组、FL实验组、TAF实验组、混合蛋白组（Mixture组）和Mock组，每组 20只；肺部组分为HlaD实验组、TAF实验组、混合蛋白组（Mixture组）和Mock组，每组20 只。纯化各实验组蛋白lmg/ml，以1 :1的比例与弗式完全佐剂进行乳化，每只200 μ 1小鼠 腿部肌肉注射免疫；首次免疫后21d，将蛋白与不完全弗氏佐剂以1 :1比例进行乳化，腿部 肌肉注射加强免疫。
[0092] 本实验取人源S. aureus Newman和牛源S. aureus HLJ23-1标准菌株进行攻毒。取 稀释好的菌液对二免后14d的小鼠腹腔攻毒及肺部灌肺攻毒，并每天记录小鼠状态以及死 亡数目，持续一周，无菌状态下解剖死亡小鼠并分离病菌，分析是否为实验攻毒菌导致小鼠 死亡。
[0093] 试验时使用SPF级ICR小鼠为模型具体分组见表3。
[0094] 表3腹腔组小鼠模型分组
[0096] 在加强免疫后14d用金黄色葡萄球菌Newman，HLJ23-1菌株以绝对致死量（金 黄色葡萄球菌Newman株以I. 5 X IOwCFUAiouse和金黄色葡萄球菌HLJ23-1分离株以 I. 0 X IOwCFlVm0Use的剂量）进行小鼠腹腔攻毒，攻毒后观察实验小鼠死亡情况并记录数 据，见表4。攻毒Newman株TAF免疫保护率为90 %，攻毒HLJ23-1株TAF免疫保护率为80 %。
[0097] 表4腔组小鼠模型攻毒结果
[0099] 小鼠肺部攻毒组米用金黄色葡萄球菌Newman株以5X 10sCFU/mouse和HLJ23-1地 方分离株以4X10sCFU/mou Se的剂量进行，攻毒后观察实验小鼠死亡情况并记录数据，见表 5。攻毒Newman株TAF免疫保护率为100 %，攻毒HLJ23-1株TAF免疫保护率为90 %。
[0100] 表5肺部组小鼠模型攻毒结果
[0103] 2、抗体水平
[0104] 用间接ELISA检测分离的血清样本中IgG含量。大量纯化实验组蛋白TAF，HlaD， FL，Trap 备用。
[0105] 包被抗原均以10 μ g/mL浓度，每孔100 μ L包被96孔酶标板，37 °C两小时，然 后用PBST洗涤。每孔加100 μ L5 %脱脂乳的PBST封闭液，37 °C封闭lh，洗涤；每孔加 入PBS稀释的待检免疫血清，37°C孵育lh，洗涤；每孔加入PBS稀释的Goat anti-Mouse IgG-Peroxidase二抗，37°C孵育lh，洗涤；每孔加入100 μ L TMB显色液，室温显色IOmin后 每孔加入50 μ L 2M的硫酸终止反应，测0D450nm吸光值。分析结果。当样品0D450值多（阴 性血清的0D450值+3倍标准方差）时即为阳性。
[0106] 结果表明重组蛋白TAF抗体效价最高，高于Trap、HlaD及FL实验组。
[0107] 表6各实验组血清中抗体IgG效价比
[0109] 3、细胞因子检测
[0110] 用Elispot方法检测IL-4、INF-γ含量。用ELISA方法检测IL-2、IL-17含量。 按细胞因子检测试剂盒的操作步骤进行。
[0111] 应用ELISP0T方法测定各实验免疫组和对照组小鼠的淋巴细胞IL-4、IFN-γ分 泌水平（表7)。重组蛋白TAF实验组中IL-4、INF-γ含量高于其他各实验组差异显著（P < 0. 05)，同对照组比较差异较显著（p〈0. 01)。
[0112] 表7各实验组细胞因子IL-4、INF-γ含量
[0115] 应用ELISA方法测定各实验重组蛋白免疫组和对照免疫组小鼠脾脏细胞上清液 中IL-2、IL-17分泌水平（表8)。所得结果经t-检验表明重组蛋白免疫组小鼠脾淋巴细 胞上清液中IL-2、IL-17分泌量同其他各实验组比较差异显著（P < 0. 05)，与对照组比较 差异较显著（P〈〇. 01)。
[0116] 表 8 IL-2、IL-17 含量分析
[0117]
[0118] 4、小鼠肺部细菌承载量实验
[0119] 检测小鼠肺炎症状与病原菌之间的病理关系，在实验小鼠攻毒一段时间后（24h)， 断颈处死，在无菌环境中取其肺部，称其重量，以Img比例加入2ml无菌PBS，充分研磨后加 入7ml无菌PBS缓冲液至10ml，200 μ 1上清液进行连续的倍比稀释，稀释后在TSA培养基 中涂板计数，记录各个实验组和对照组中菌落数目，并分析数据结果。
[0120] 结果：重组蛋白TAF实验组肺部承载量最低，HlaD免疫组其次，对照组最低，如图 9所示。
[0121] 以上结果表明，本发明TAF融合蛋白疫苗的免疫效果优于各蛋白单独或混合在一 起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具 有更好的免疫原性及免疫保护作用。
[0122] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段，其特征在于：包括FnBPA蛋白N区域中 301-430位氨基酸和FnBPA蛋白rl-ΙΙ区域中FnBPArl〇-ll的801-874位氨基酸两个片段， 其氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。2. 编码权利要求1所述的免疫优势片段的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。3. 权利要求1所述的金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段在制备金黄色葡萄球菌疫苗 中的应用。4. 一种金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白，其特征在于：是由金黄色葡萄球菌的TRAP蛋 白、α-溶血素免疫优势片段和金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段融合而成，其氨基酸序 列如SEQIDNo. 4所示。5. 编码权利要求4所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。6. 权利要求4所述的融合蛋白的制备方法，包括用权利要求5所述的基因克隆至原核 细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。7. 权利要求4所述的融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段，并且提供了该免疫优势片段的编码基因。本发明还涉及了一种含有金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段的融合蛋白，是由金黄色葡萄球菌的TRAP蛋白、α-溶血素免疫优势片段和金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段融合而成，并且提供了该融合蛋白的编码基因、制备方法以及用途。利用本发明的TAF融合蛋白对小鼠免疫攻毒试验，表明TAF融合蛋白具有较好的免疫保护性效果，是金黄色葡萄球菌的理想疫苗抗原，在新型疫苗的开发应用方面具有重要的价值。
【IPC分类】C07K19/00, C07K14/31, C12N15/62, A61P31/04, C12N15/31, A61K39/085
【公开号】CN105384800
【申请号】CN201510889714
【发明人】于立权, 崔玉东, 刘道龙
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月7日