的PBS缓冲 液（20mM磷酸盐，pH7. 4)平衡柱子，上样，收集流出液检测，用10倍体积PBS缓冲液（0.02 mol/L磷酸盐，pH7.4)洗涤除去杂蛋白，然后使用0.1M甘氨酸缓冲液（pH3)将目的蛋白从 柱上洗脱，即为本发明的新型融合蛋白VNI。通过SDS-PAGE检测，该新型融合蛋白VNI的纯 度达到90%以上。
[0033] 实施例2.VNI结合动力学分析 (一）VNI和VEGF-A的结合动力学分析 通过Loading将25yg/mlBiotin-hVEGF-A结合于SAsensor上；根据预实验设置浓 度范围：分别为 10000、5000、1000、500、100nM，以SampleDiluentbuffer为空白对照。于 OctetQK检测平台中的动力学分析进行hVEGF-A与VNI、VEGF-Trap和PD1抗体的动力学 参数检测，试验步骤设置如表1所示： 表1
通过上述试验步骤检测得到的实验结果如表2所示： 表2结合动力学参数比较
如上表2显示，VNI仍保持与VEGF-A的高亲和力，在体外仍能很好地结合VEGF-A;但结 合力弱于VEGF-TRAP。而ro-1抗体与VEGF-A几乎没有结合。
[0034] (二）VNI和ro-i的结合动力学分析 通过Loading将25μg/mlBiotin-hro-l结合于SAsensor上；根据预实验设置浓 度范围：分别为 10000、5000、1000、500、100nM，以SampleDiluentbuffer为空白对照。于 OctetQK检测平台中的动力学分析进行hH)-l与VNI、VEGF-Trap和PD1抗体的动力学参 数检测，试验步骤设置如表3所示： 表3
通过上述试验步骤检测得到的实验结果如表4所示： 表4结合动力学参数比较
如上表4显示，vni与ro-i保持高亲和力结合，但结合力弱于ro-i抗体。而ro-i抗 体片段或者拮抗剂与ro-i结合力非常弱。
[0035] 综上所述，VNI在体外仍能保持与VEGF-A和ro-l高亲和结合，推测该分子有高效 体内活性。
[0036] 实施例3.VNI的体外生物学活性检测。
[0037] (一）对HUVEC细胞增殖的影响比较研究 对数生长期的HUVEC细胞接种于96孔培养板，3X103cells/孔，100y1/孔，37 °C， 5%C02培养20h;用Base培养基配制不同摩尔浓度的VNI、PD-1抗体及VEGF-Trap(9. 7~ 10000ng/ml)分别与40ng/ml的VEGF混匀，37°C孵育2h;再加之接种有HUVEC细胞的96孔 板上，100y1/孔，每组3复孔，37°C，5%0)2继续孵育96h，阴性对照组加分别加Base培养 基和完全培养基；加CCK-8试剂，20y1/well，37°C避光孵育2h，450nm检测吸光值，VNI对 HUVEC细胞增殖影响的EC50值曲线示意图如图1所示，实验结果如表5所示。
[0038] 表 5
通过表5以及图1显示，VNI的体外生物学活性略低于VEGF-Trap，而H)-l抗体对VEGF刺激HUVEC细胞增殖活性基本没有抑制作用。
[0039] (二）对巨细胞病毒裂解物刺激PBMC细胞的细胞因子分泌的影响 从CMV阳性（曾感染过巨细胞病毒）的供体分离外周血单个核细胞（PBMC)，CMV裂解 物能刺激这类细胞产生IFNy，抗H)-l抗体可增强CMV裂解物刺激PBMC产生IFNy。
[0040] 将105个来自CMV阳性供体的人PMBC在总体积200y1中培养，并在每个孔中 加入CMV裂解物。将各种浓度的抗ro-i抗体、VNI和ro-i抗体片段或者拮抗剂加到每个 孔中。常规条件培养细胞第4天后，从每份培养物中取100yl培养基用于细胞因子IFNy 测量，VNI刺激PBMC产生IFNy的曲线示意图如图2所示，测量结果如表6所示。
[0041] 表 6
通过图2和表6显示，在CMV裂解物作用下，VNI呈浓度依赖刺激PBMC细胞产生IFNY， 在低浓度时其作用能力低于ro-1抗体，但在高浓度时与ro-1抗体作用相当。VEGF-TRAP基 本不能刺激PBMC产生IFNy。
[0042] 实施例4.鼠源VNI抑制小鼠体内移植肿瘤生长作用研究 由于小鼠ro-i与人源化人源ro-i抗体不具有交叉作用，进而导致人源ro-i抗体在小 鼠体内无法阻断ro-i作用，在小鼠体内不能发挥ro-i抗体抑制肿瘤生长作用，因而本发明 采用鼠源VNI体内处理植入有癌性肿瘤的小鼠以检验抗体对肿瘤生长的体内影响。
[0043] 鼠源ro-i抗体和鼠源VNI的制备：首先用小鼠ro-i免疫大鼠，参照《组织培养和 分子细胞学技术》（鄂征主编）杂交瘤细胞制备方法，获得抗小鼠ro-i抗体基因，将该基因 重组至真核表达载体中，获得鼠源ro-i抗体，该抗体作为对照备用；然后，另将本发明中融 合蛋白VNI的人源抗ro-1抗体fab序列替换成小鼠ro-1抗体基因的fab序列，形成抗小 鼠ro-1抗体和VEGF-TRAP的融合蛋白鼠源VNI，将该序列重组至真核表达载体中，经转染、 表达和纯化获得重组鼠源VNI。
[0044] 根据体重将6-8周龄之间的雌性AJ小鼠随机分成6组，每组包含10只动物。在 第〇天将溶于200y1DMEM培养基的2X106个SA1/N纤维肉瘤细胞在右侧皮下植入小鼠。 用PBS对照或10mg/kg的药物处理小鼠。在第1、4、8和11天用大约200y1含有药物的 PBS或对照通过腹膜内注射给动物剂量给药。各组组成如下：（1)PBS对照组，（2)鼠源VNI 组，（3)鼠源H)-l抗体组，（4)VEGF-TRAP组。对小鼠每周两次监测肿瘤生长，持续大约8 周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量（高度X宽度X长度）并计算肿瘤体积。当 肿瘤达到肿瘤终点（1500mm3)或显示大于15%的体重减少时将小鼠处死，药物处理后无 肿瘤鼠占百分比如表7所示，鼠源VNI在体内抑制肿瘤生长的情况如图3所示。
[0045] 表 7
上述对比实验中，PBS组中9只鼠约在28天达到肿瘤终点，有1只鼠肿瘤溃烂；鼠源VNI组3只鼠在56天达到肿瘤终点，其余7只无肿瘤；鼠源H)-l抗体组7只鼠在56天达 到肿瘤终点，其余3只鼠无肿瘤；VEGF-TRAP组有6只鼠在42天达到肿瘤终点，其余4只鼠 在49天达到肿瘤终点。
[0046] 通过图3、表7以及上述实验结果描述可知：本发明的新型融合蛋白VNI，其不仅仅 能同时具有两种抗体分别饥饿肿瘤细胞、以及激活T细胞杀伤肿瘤细胞的功能，而且还能 达到两种功能的协同促进作用，使抑制肿瘤生长的功能更加显著；并且，通过图3所示，采 用本发明的新型融合蛋白还具有有效延长各抗体单元生理活性功能效果的作用。
[0047] 实施例5 本实施例中X的核苷酸编序列和Y的核苷酸编序列不同，本实施例中所述X的核苷酸 编码序列为SEQ ID N0 :4,所述Y的核苷酸编码序列为SEQ ID N0 :8。所述IgG Fc片段为 IgG3 Fc片段，该IgG3 Fc片段核苷酸编码序列为SEQ ID NO :14。
[0048] 实施例6 本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中所述IgG Fc片段为IgG2 Fc片段，该IgG2 Fc片段核苷酸编码序列为SEQ ID NO :12。
[0049] 上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用 本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新型融合蛋白，其特征在于，其结构通式如下： X-连接肽-Y-连接肽-IgG Fc片段或Y-连接肽-X-连接肽-IgG Fc片段； 其中，X为VEGF-Trap及其衍生物；Y为H)-l抗体片段及其衍生物或者H)-l拮抗剂片 段及其衍生物。2. 根据权利要求1所述的一种新型融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为式 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ) n所示的氨基酸序列，该n是1~4的整数。3. 根据权利要求1所述的一种新型融合蛋白，其特征在于，所述X的氨基酸序列为SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :3,所述 Y 的氨基酸序列为 SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :7。4. 根据权利要求1所述的一种新型融合蛋白，其特征在于，所述X的核苷酸编码序列 为SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4,所述Y的核苷酸编码序列为SEQ ID NO :6或SEQ ID NO : 8〇5. 根据权利要求1所述的一种新型融合蛋白，其特征在于，所述IgG Fc片段为IgGl Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段或IgG4 Fc片段；该IgGl Fc片段氨基酸序列为SEQ ID NO :9,该IgG2 Fc片段氨基酸序列为SEQ ID NO :11，该IgG3 Fc片段氨基酸序列为SEQ ID NO: 13,该IgG4 Fc片段氨基酸序列为SEQ ID NO: 15。6. 根据权利要求1所述的一种新型融合蛋白，其特征在于，所述IgG Fc片段为IgGl Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段或IgG4 Fc片段；该IgGl Fc片段核苷酸编码序列为 SEQ ID NO: 10,该IgG2 Fc片段核苷酸编码序列为SEQ ID NO: 12,该IgG3 Fc片段核苷酸 编码序列为SEQ ID NO :14,该IgG4 Fc片段核苷酸编码序列为SEQ ID NO :16。7. -种制备新型融合蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1-6任一项所述新型融合 蛋白的编码核苷酸序列插入表达载体中，并将此表达载体引入相应的表达系统进而进行融 合蛋白的表达。8. -种药物组合物，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的新型融合蛋白与药学 上可接受的载体或赋形剂组成。9. 根据权利要求8所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的制剂形式 为注射剂、注射用冻干粉针。10. -种新型融合蛋白的用途，其特征在于，所述权利要求1-6任一项所述的新型融合 蛋白用于肿瘤的治疗；所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、 卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列 腺癌中的一种或多种。
【专利摘要】本发明公开的是一种新型融合蛋白，以及该新型融合蛋白组成的药物组合物及该新型融合蛋白的制备方法和用途。本发明中该新型融合蛋白的结构通式如下：X-连接肽-Y-连接肽-IgG？Fc片段或Y-连接肽-X-连接肽-IgG？Fc片段；其中，X为VEGF-Trap及其衍生物；Y为PD-1抗体片段及其衍生物或者PD-1拮抗剂片段及其衍生物。本发明具有新生血管抑制和T细胞免疫激活作用，而且还具有两种功能的协同促进的作用，使抑制肿瘤生长的功能更加显著。
【IPC分类】A61K39/395, C07K19/00, A61P35/00, C12N15/62, A61K47/48
【公开号】CN105111314
【申请号】CN201510493826
【发明人】雷霞, 张仕琼
【申请人】成都百世博生物技术有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月13日