抗nogo-66受体(ngr)的中和单克隆抗体及其用图
【专利说明】抗N0G0-66受体（NGR)的中和单克隆抗体及其用途
[0001] 本申请是国际申请日为2007年11月21日的国际申请PCT/US2007/085349进入 中国、申请号为200780050241. 5的题为"抗N0G0-66受体（NGR)的中和单克隆抗体及其用 途"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求享有2006年11月21日提交的临时申请序列号60/860, 256的优先权。
技术领域
[0003] 本申请描述了Nogo-66受体结合蛋白，尤其是单克隆抗体，其能够结合Nogo-66受 体并中和Nogo-66受体的功能。因此这些抗体可用于治疗数种疾病，包括但不限于哺乳动 物脑外伤、脊髓损伤、中风、神经变性疾病和精神分裂症。
【背景技术】
[0004] 损伤后哺乳动物中枢神经系统（CNS)内的轴突再生通常是不可能的；其结果取决 于CNS内神经纤维再生的固有能力与CNS内抑制因子的平衡，所述抑制因子集中在损伤部 位的微环境中，主动防止再生从而阻止受损纤维束的再生。
[0005] 已经证明由少突胶质细胞产生的CNS髓磷脂通过在体外及体内引起生长锥萎缩， 是损伤早期轴突生长最相关的抑制（non-permissive)因子，其导致轴突生长的直接抑制 (综述参见：Lee等人，2003)。直到最近才鉴定出CNS髓磷脂的主要抑制因子：少突胶质细 胞髓磷脂糖蛋白（OMgp)，髓磷脂相关糖蛋白（MAG)和N〇g〇-A(D〇meniC〇ni等人，2002;综 述：Woolf&Bloechinger，2002 ;McGee&Strittmatter，2003;Lee等人，2003)。后一蛋白包含 结构域Nogo-66 (GrandPr6等人，2000)，其行使主要抑制功能。有趣地是，所有3种抑制蛋 白在CNS中都显示高表达水平，并与相同的神经元糖基化磷脂酰肌醇（GPI)部分锚定的受 体（Nogo-66 受体或NgR)相互作用（Fournier等人，2001)。Nogo-66 受体（NgR)是 473 个 氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇连接蛋白。它由N末端信号序列，然后是8亮氨酸富集重复结 构域、亮氨酸富集重复C端结构域（共同形成所谓的胞外域）和GPI锚定结构域组成。通 过GPI锚，NgR与外部神经元质膜连接。
[0006]NgR自身属于3种CNS富集的GPI锚定蛋白（被称为NgR、NgR2和NgR3)的家族， 具有约40%的序列同一,性，但就整体结构组织来说非常类似（Barton等人2003 ;Lauren等 人2003 ;Pignot等人2003)。尽管NgR是已知的唯一与多种髓磷脂相关抑制分子相互作用 的成员，但最近显示MAG也与NgR2相互作用（Venkatesh等人2005)。NgR同系物的功能目 前是未知的。NgR自身在啮齿类动物或小鸡发育的早期不表达，但在成年动物中显示高表达 水平；NgR在大部分（如果不是全部）CNS区域中表达，包括脊髓（Hunt等人，2002a，b)。已 经证明小鸡（Fournier等人，2001)、大鼠（Hunt等人，2002a)和小鼠（Wang等人，2002b)中 mRNA和蛋白水平的脊髓表达。在成年CNS组织内，NgR蛋白在所有成熟的神经元（包括它 们的轴突末梢）中表达。配体结合NgR起始胞内信号级联反应，其导致轴突生长抑制和生 长锥萎缩。因为NgR不包含跨膜结构域，信号转导需要将NgR/配体相互作用信号转导入细 胞的共受体。NgR信号转导的起始步骤是其与共受体p75或TR0Y的相互作用（Wong等人， 2002 ;Shao等人，2005 ;Park等人，2005)。已经鉴定出第二共受体，被称为Lingo-1。只有NgR、P75或TROY与Lingo-1的三元复合物构成的才是功能性信号复合物（Mi等人，2004; Park等人，2005)。该信号转导的结果是肌动蛋白细胞骨架的重排。在神经元中，这种肌动 蛋白细胞骨架的变化引起轴突生长的抑制及生长锥萎缩的诱导。
[0007] 体外，来自NgR(_/_)小鼠的背根神经节细胞与Nogo66的结合能力较低，在生长锥 萎缩分析中对N〇g〇66、Fc-MAG、OMgp或髓磷脂的抑制作用反应较弱（Kim等人，2004)。在 部分或完全的脊髓损伤后，NgR(-/_)小鼠显示脑干束（brainstemtracts)再生的增加，所 述脑干束包括红核脊髓束和中缝脊髓束（raphespinaltracts)。甚至在脊髓的完全实验 性横切后，NgR(-/_)小鼠在旷场试验中显示增强的功能恢复。在脊髓的半切除及完全横切 后，NgR(-/_)小鼠中的恢复显著好于纯合的（+/+)和杂合的同窝小鼠（Kim等人，2004)。
[0008] 本申请描述了抗NgR的中和单克隆抗体的制备，该抗体选择性的竞争Nogo-66结 合，并且被预期改善一些病症，在所述病症中NgR活性可能是有害的。本发明的中和单克隆 抗体被预期例如促进受损CNS的神经元再生，尤其是在急性脊髓损伤、脑外伤或神经变性 疾病（诸如，亨廷顿氏舞蹈病，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病或多发性硬化）之后。
【附图说明】
[0009]图la和lb:抗体mAb50和mAb51结合人和大鼠NgR。
[0010]图 2:mAb50 和mAb51 与AP_Nogo66 结合NgR-Fc的竞争。
[0011] 图3:mAB50和mAB51与Nogo66结合HEK293f细胞上表达的人和大鼠NgR的竞争。
[0012] B4：mAB50 和mAB51 与NTera2 细胞的结合。
[0013] 图5:NTera2细朐闭块中轴突牛长的宙量。
[0014] 图6:hNgR的缺失突夺体。
[0015]图 7:MAG-Fc结合NgR-Fc的竞争。
[0016] 许可和抑制条件下的大鼠背根神经节神经元，及mAb50对Nogo66诱导的轴 突生长抑制的中和。
[0017] 大鼠DRG细胞中mAB50和mAb51对Nogo66诱导的轴突生长抑制的中和。
[0018] 序列表
[0019]SEQIDNO. 1A:人NGR蛋白
[0020] SEQIDNO. lb :人NgR核苷酸
[0021] SEQIDNO. 2a :大鼠NgR蛋白
[0022] SEQIDNO. 2b :大鼠NgR核苷酸
[0023]SEQIDNO. 3:抗体克隆 50VH
[0024]SEQIDNO. 4:抗体克隆 50VL
[0025]SEQIDNO. 5:抗体克隆 51VH
[0026]SEQIDNO. 6:抗体克隆 51VL
[0027]SEQIDNO. 7a:AP-N0G0-66 蛋白
[0028]SEQIDNO. 7b:AP-Nogo_66 核苷酸
【发明内容】
[0029] 本申请涉及与Nogo受体（NgR)相互作用的分离的结合蛋白，尤其是结合并中和人 及大鼠NgR的中和单克隆抗体。这些抗体能够与Nogo-66竞争结合NgR。本申请的其他方 面包括利用上述结合蛋白制备药物组合物的方法，及使用这种结合蛋白的方法。
[0030] 抗体
[0031] 本申请的主要实施方案包括分离的蛋白或多肽，它们特异性结合Nogo-66受体 (NgR)的至少一个表位。术语"分离的蛋白"或"分离的多肽"是根据其起源或衍生来源与 其天然状态伴随的天然结合组分不结合的蛋白多肽；基本上不含相同物种的其他蛋白；由 不同物种的细胞表达；或在自然界不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源的细胞 的细胞系统中合成的多肽将从其天然结合组分"分离"。利用本领域公知的蛋白纯化技术通 过分离也可以使蛋白基本上不含天然的结合组分。本文使用的术语"多肽"是指氨基酸的 任何聚合链。术语"肽"和"蛋白"与术语多肽可以互换使用，也表示氨基酸的聚合链。术 语"多肽"包括天然或人工蛋白，蛋白片段及蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚 合的。
[0032] 特异性结合Nogo-66受体（NgR)的至少一个表位的分离的蛋白或多肽能够抑制配 体与所述NgR的结合。Nogo-66受体（NgR)是473个氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇连接蛋白。 它由N末端信号序列，然后是8亮氨酸富集重复结构域、亮氨酸富集重复C端结构域（共同 形成所谓的胞外域）和GPI锚定结构域组成。通过GPI锚，NgR与外部神经元质膜连接。本 发明的蛋白优选的是与人NgR的至少一个表位结合的单克隆中和抗体或其抗原结合片段。 Nogo-66是CNS髓磷脂的数种主要抑制因子之一，其诱导轴突生长的抑制并促进圆锥体生 长的萎缩。
[0033] 本文使用的术语"抗体"旨在表示由4条多肽链（由二硫键互连的两条重（H)链 和两条轻（L)链）组成的免疫球蛋白分子。如果抗体能够与一种分子特异性反应从而使该 分子与抗体结合，则该抗体被称为"能够结合"该分子。术语"表位"表不任意分子能够被 抗体结合的部分，其也可被该抗体识别。表位或"抗原决定簇"通常由分子的化学活性表面 基团（诸如氨基酸或糖侧链）组成，具有特定的三维结构特征及荷质比特性。
[0034] 本文使用的术语抗体的"抗原结合片段"（或简单地"抗原片段"）是指抗体的一个 或多个部分，它们分别保留特异性结合受体及活化或调节该受体的能力。已经证明抗体的 抗原结合功能可以由全长抗体的片段行使。术语抗体的"抗原结合部分"包含的结合片段 的实例包括（i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；（ii)F(ab' )2片段， 包括通过绞链区的二硫键连结的两个Fab片段的二价片段；（iii)Fd片段，由VH和CH1结构 域组成；（iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；（v)dAb片段（Ward等人（1989) Nature341 :544-546)，由VH结构域组成；和（vi)分离的CDR。此外，尽管Fv片段的两个 结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以利用重组方法通过合成接头将它们连接，所述 合成接头使VL和VH能够被制备为单个蛋白链，其中VL和VH区域配对形成被称为单链 Fv(scFv)抗体的单价分子。（参见，例如，Bird等人（1988)Science242 :423_426;Huston 等人（1988)ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA85:5879-5883.)这 类scFv抗体还旨在被术语抗体的抗原结合部分包括。其他形式的单链抗体，诸如双体也被 该术语包括。双体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使 用的接头太短从而不允许所述两个结构域在相同链上配对，从而迫使所述结构域与另一条 链的互补结构域配对，在相同受体上或跨越两个受体分子产生两个抗原结合位点。（参见， 例如，Holliger等人（1993)ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA90: 6444-6448;Poljak等人（1994)Structure2:1121-1123)。
[0035] 本文使用的"单克隆抗体"旨在表示抗体分子的制剂，与包含不同抗体的混合物 的"多克隆"抗体制剂不同，单克隆抗体具有共同的重链和共同的轻链氨基酸序列。单克隆 抗体可以通过数种新技术产生，例如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示，以及典型方法诸如 杂交瘤来源的抗体（例如，由杂交瘤技术制备的杂交瘤分泌的抗体，诸如标准的Kohler和 Milstein杂交瘤方法（（1975)Nature256:495-497)。本发明的抗体是利用哺乳动物细胞 系产生的NgR蛋白在小鼠中通过标准免疫/杂交瘤技术产生。
[0036] 本文使用的"中和单克隆抗体"旨在表示一种抗体分子制剂，其在与特定抗原结合 时能够竞争并抑制天然配体与所述抗原的结合。在本申请的特定情况下，本发明的中和抗 体能够与Nogo66竞争结合NgR，并预防由Nogo66结合NgR引起的Nogo66生物活性或功能。 [0037] 优选的，本申请的单克隆中和抗体是人抗体。术语"人抗体"是指具有对应于 或源自人类的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区（例如，参见Kabat等人Sequencesof ProteinsofImmunoloRicalInterest,第五版，美国健康与社会服务部，NIH出版号 91-3242,1991)。但是，本申请的人抗体可以在例如CDRs尤其是CDR3中包括不是由人类免 疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在体内通过 体细胞突变引入突变）。本文使用的术语"CDR"是指抗体可变序列内的互补决定区。在重 链和轻链的每个可变区内存在3个CDRs，在每个可变区中分别被称为CDR1、CDR2和CDR3。 在不同的实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。本申请最优选的中和抗体在本文中 被称为mAb50 和mAb51(ATCC号分别为PTA-8383 和PTA-8384)。mAb50 和mAb51 抗体及功 能性抗体片段，mAb50和mAb51相关抗体及功能性抗体片段，及与mAb50和mAb51具有相同 特性（诸如结合NgR的高亲和力及低解离动力学和高中和能力）的其他抗体和功能性抗体 片段被预期作为本发明的一部分。
[0038] 本申请抗NgR抗体与免疫原性NgR多肽或其片段的结合亲和力和离解速率可以通 过本领域已知的任何方法确定。例如，可以通过竞争性ELISAs、cRIAs、BIAcore或KinExA 技术测量结合亲和力。还可以通过BIAcore或KinExA技术测量离解速率。利用例如BIAcore 通过表面等离子体共振测量结合亲和力和离解速率。
[0039] 本申请优选的抗体与mAB50抗体的序列具有至少90 %的氨基酸序列同一性，所述 mAB50抗体的序列包括重链可变区（VH区）（包含SEQIDN0 :3的序列）和轻链可变区（VL 区）（包含SEQIDN0:4的序列）。另一个优选的实施方案与mAB51抗体的序列具有至少 90%的氨基酸序列同一性，所述mAB51抗体的序列包括重链可变区（VH区）（包含SEQID NO:5的序列）和轻链可变区（VL区）（包含SEQIDNO:6的序列）。
[0040] 优选的，mAb50和mAb51抗体与人NgR结合的EC5。小于1X10 9M，更优选的所述抗 体与NgR结合的EC5。小于1X10 '和最优选的所述抗体与NgR结合的EC5。小于4 X10nM。 [0041] 预期抗NgR抗体mAb50和mAb51结合各种形式的人NgR，包括pro-NgR、成熟的NgR 和截短的NgR。抗体mAb50和mAb51不与其他NgR同系物（例如NgR2或NgR3)或其他包 含LRR的蛋白特异性结合。但是，抗体mAb50和mAb51显示与其他种属NgR(尤其是啮齿类 动物NgRs，更具体的是大鼠NgRs)的交叉反应。此外MAb52到62还与小鼠NgR交叉反应。 例如，所述抗体结合大鼠NgR(两种抗体对大鼠NgR的IC5。约为3X10nM)。
[0042] 还预期与本申请的（NgR)相互作用的分离的结合蛋白可以是糖基化结合蛋白，其 中其抗体或抗原结合部分包括一个或多个碳水化合物残基。新生的体内蛋白生成可以经受 进一步加工，被称为翻译后修饰。尤其是，可以通过酶法（称为糖基化的过程）添加糖（糖 基）残基。获得的载有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。蛋白糖基 化取决于目标蛋白的氨基酸序列，以及表达该蛋白的宿主细胞。不同的生物体可能产生不 同的糖基化酶（例如，糖基转移酶和糖苷酶），并提供不同的底物（核苷酸糖）。由于这类 因素，蛋白糖基化模式及糖残基的组成将根据表达该特定蛋白的宿主系统而不同。可用于 本发明的糖残基可以包括，但不限于，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，n-乙酰葡糖胺和唾 液酸。优选的糖基化结合蛋白包括使糖基化模式是人的糖残基。
[0043] 本申请的抗体包括重链恒定区，诸如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD 恒定区。此外，所述抗体可以包括轻链恒定区，k轻链恒定区或A轻链恒定区。优选的，所 述抗体包括k轻链恒定区。可选择地，抗体部分可以是诸如Fab片段或单链Fv片段。用 以改变抗体效应物功能的Fc部分氨基酸残基的替换是本领域已知的（Winter，等人美国专 利号5, 648, 260 ;5, 624, 821)。抗体的Fc部分介导数种重要的效应物功能，诸如细胞因子 诱导，ADCC，吞噬作用，补体依赖性细胞毒性（CDC)和及抗体和抗原抗体复合物的半衰期/ 清除率。一些情况下这些效应物功能是治疗性抗体需要的，但在其它情况下可能不是必需 的或甚至是有害的，这取决于治疗目的。某些人IgG同种型，尤其是IgGl和IgG3,分别通过 结合FcyRs和补体Clq来介导ADCC和CDC。新生的Fc受体（FcRn)是决定抗体循环半衰 期的关键组分。仍在另一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体的恒定区（诸如抗体 的Fc区）被取代，这样的话该抗体的效应物功能被改变。
[0044] 重组蛋白的产牛
[0045] 为了进行免疫和ELISA分析，以及轴突生长分析（在"实施例"部分描述），制备可 溶性重组人和大鼠NgWs。此外，制备与碱性磷酸酶