一种鲑鱼降钙素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制药技术领域，具体涉及到一种鲑鱼降钙素的制备方法。
【背景技术】
[0002] 鲑鱼降f丐素，英文名：Calcitonin(Salmon)，化学结构式如式I:
[0003]
[0004] 天然降钙素是由哺乳动物的甲状旁腺细胞或非哺乳类有脊椎动物的后腮体所分 泌的一种生物活性多肽，是生物体内钙调节的主要因子。其中，鲑鱼降钙素具有抑制破骨细 胞的活性，从而抑制骨盐溶解，阻止骨内钙释出，改善骨密度，有效缓解疼痛症状，降低骨折 的危险性，降低血钙的作用，广泛应用于临床治疗老年骨质疏松症，绝经后骨质疏松症，骨 转移癌致尚f丐血症。
[0005]目前，鲑鱼降钙素的合成方法多是利用Fmoc-策略固相法合成鲑鱼降钙素，具体 步骤如下：Fmoc-RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂脱Fmoc-保护后按照固相 合成的方法依次连接各种保护氨基酸得到保护三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基 团，脱侧链保护基团及切肽同步进行，得还原型粗品，粗品经弱碱空气氧化反应，并经反相 HPLC分离纯化，制得鲑鱼降钙素精品。但由于鲑鱼降钙素由32个氨基酸组成，属于中长肽， 空间位阻大，合成收率较低。
[0006] 例如，在已经公开的中国专利CN104672320A中，其公开了使用逐一偶联的方式将 多种氨基酸片段连接在载体树脂上，再经过分离纯化获得鲑鱼降钙素精品。该文献公开的 即是采用逐一将氨基酸接入树脂上，此外，另一种方式是将部分氨基酸形成多肽片段再接 入树脂上。例如在已经公开的中国专利文献CN104177490A中，公开了将32个氨基酸使用 三个多肽片段进行偶联，其中第一肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第1-10位氨基酸，且 第1位和第7位半胱氨酸形成二硫键，第二肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第11-23位 氨基酸，第三肽片段序列为鲑鱼降钙素序列中的第24-32位氨基酸。
[0007] 在将氨基酸片段与树脂偶联的过程中，往往是通过保护氨基片段与树脂偶联，例 如Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ser(tBu)与树脂偶联时先需要进行脱Fmoc保护剂，然后将Cys 或者Ser接入树脂上。在实际偶联过程中，偶联方式对成本和总收率有一定影响。例如，在 使用逐一方式进行偶联过程中，发明人发现，单个氨基酸逐一偶联过程中，需要使用到含有 Gly的氨基酸片段，该氨基酸片段在偶联前为Fmoc-Gly-〇H，当接入该保护氨基酸片段后， 发明人发现在反应环境中产生了 [+lGly]_鲑鱼降钙素和[_lGly]_鲑鱼降钙素杂质，该杂 质的化学特性与鲑鱼降钙素近似，使得分离时需要通过多次反复的纯化工艺来去除这类杂 质，进而导致了生产成本高，总收率较低。
[0008] 在使用若干多肽片段进行偶联时，首先是原料本身的成本较高，在进行化学偶联 时原料的投料比较大，使得实际的原料利用率较低。更重要的是，使用多肽片段时由于空间 位阻的关系，多肽片段不易与树脂偶联，使得投料比较大；进而增加了成本。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种鲑鱼降钙素的制备方法，可以提高产品的纯度，降低生 产成本。
[0010] 为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种鲑鱼降钙素的制备方法，包括 以下步骤：
[0011](1)、将Fmoc-Pro-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Pro-树脂；
[0012](2)、将所述Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸和保护肽片段逐一偶联获得鲑鱼降钙 素线性肽树脂，其中
[0013] 第3位~第5位三个保护氨基酸是以保护肽片段Z进行偶联；
[0014] 第20位~第21位和第28位~29位两个保护氨基酸均是以保护肽片段X进行偶 联；
[0015] 第23位~第24位两个保护氨基酸是以保护肽片段Y进行偶联；
[0016] 其偶联氨基酸片段为：
[0017]Fmoc-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-X(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Y-Lys(Bo c)-X(tBu)-Gin(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gin(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)_Z(tBu)-Thr(tBu) -Pro-树脂，
[0018]其中X为Leu-Ser，Y为Leu-Gly，Z为Gly-Ser-Gly;
[0019] (3)、将鲑鱼降钙素线性肽树脂在裂解液中裂解，得到还原性粗品；
[0020](4)、将所述还原性粗品使用氧化剂氧化，得到氧化粗品；
[0021] (5)、将所述氧化粗品纯化，得到鲑鱼降钙素精品。
[0022] 优选的，与Fmoc-Pro-OH偶联的树脂为Fmoc-RinkAmideMBHA树脂或RinkAmide AM树脂。
[0023]Fmoc-Pro-载体树脂是Fmoc-Pr〇-〇H与去Fmoc保护基团的Fmoc-RinkAmideMBHA 树脂偶联得到；最优选，Fmoc-Pro-树脂是取代值为0. 45mmol/g的树脂。
[0024] 本发明中，是以Fmoc-Pro-树脂中Pro氨基酸为第一位氨基酸，依次类推计算位数 序号，并以Cys氨基酸为第32位即最后一位氨基酸。
[0025] 优选的，步骤（1)和步骤（2)的偶联反应中加入活化剂，所述活化剂为1-羟基苯 并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
[0026] 优选的，步骤（1)和步骤（2)中选用的缩合剂为N，N_二异丙基碳二亚胺、六氟磷 酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2- (7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四 甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑_N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸盐或0-苯并三氮 唑4州州'，^-四甲基脲四氟硼酸酯中的一种；或者偶联剂即缩合剂是01(：、三乙胺和 N-乙基对甲苯胺混合溶液；该混合溶液中摩尔比DIC:三乙胺：N-乙基对甲苯胺为100:2~ 5:2~5。缩合剂的摩尔用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的1. 2倍~6倍，优选为2. 5~ 4. 5 倍。
[0027] 优选的，步骤（1)和步骤（2)中选用的去Fmoc保护试剂为哌啶/N，N_二甲基甲酰 胺混合溶液，混合溶液中含哌啶为10%~30% (v/v)。活化试剂的用量为氨基树脂中氨基 总摩尔数的1. 2倍~6倍，优选的为2. 5~4. 5倍。
[0028] 优选的，步骤⑵中，接入X对应的保护肽片段为Fmoc-Leu-Ser (tBu) -OH ; 接入Y对应的保护肽片段为Fmoc-Leu-Gly-OH ;接入Z对应的保护肽片段为 Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly - 0H。
[0029] 优选的，保护氨基酸或保护肽片段的用量为树脂总摩尔量的2倍~6倍；更优选为 2~4倍。
[0030] 优选的，Fmoc-Pro-树脂的取代值为0? 2mmol/g~1. 0mmol/g ;更优选 Fmoc-Pro-树脂的取代值为0? 3~0? 6mmol/g〇
[0031] 优选的，步骤（2)中，Fmoc-Pro-树脂与保护氨基酸和保护肽片段偶联时，先反应 得到的保护氨基酸树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应；耦联反应结 束和脱去Fmoc保护后经过Kaiser Test检测。
[0032] 优选的，步骤（3)中，裂解液含有三氟醋酸80 %~95 % (v/v)、l，2-乙二硫醇 1%~10% (v/v)、三异丙基硅烷1%~5% (v/v)，溶剂为水；更优选的混合溶剂的体积配 比为：TFA为90 %、EDT为4%，TIS为2 %，余量为水。
[0033] 优选的，每克鲑鱼降钙素肽树脂使用的裂解剂用量为5~15mL;优选的，每克鲑鱼 降钙素肽树脂使用的裂解剂用量为9~llmL;裂解时间为室温，裂解时间为2~6小时，优 选的为3~4小时。
[0034] 优选的，步骤（4)中，将所述还原性粗品溶于乙腈水溶液中，使用氧化剂碘/甲醇 溶液进行氧化。
[0035] 本发明通过将Gly氨基酸片段与相邻氨基酸片段连接后再与载体树脂偶联，使得 在偶联环境中无[+lGly]_鲑鱼降钙素和[_lGly]_鲑鱼降钙素杂质，降低了原料的有效利 用率，进而降低了生产成本。
[0036] 其次，在还原性粗品进行氧化过程中，现有技术是将粗品加入含有水的氧化剂中 进行，通常的氧化剂为双氧水或者氧气。本发明的粗品首先在乙腈水溶液中溶解，并通过碘 /甲醇混合溶液进行氧化，可以提高氧化的效率，减少氧化终点的时间。
【具体实施方式】
[0037] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0038] 本发明所使用的缩写的含义列于下表中。
[0039]
[0040]
[0041] 本发明使用的氨基酸相对应的保护氨基酸对照表
[0042]
[0043]实施例1
[0044] 制备鲑鱼降钙素肽树脂：
[0045] 以Fmoc-Pro-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶