楸树CabuAP3蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种楸树CabuAP3蛋白及其编码基 因与应用。
【背景技术】
[0002] 楸树（CatalpabungeiC.A.Mey.)是我国特有的紫葳科梓树属（Catalpa)植物， 高大落叶乔木，分布在我国的河北、河南、山东、山西、陕西、甘肃、江苏、浙江、湖南等省份， 另外在广西、贵州、云南等地也均有栽培。因其树形通直，材质致密，坚固耐用，用途广泛，自 古就有"木王"之称，是我国重要的珍贵用材树种；同时，楸树树形优美，花大色艳，具有较高 的观赏价值，常作为庭院观赏植物。
[0003] APETALA3(AP3)基因是参与调控拟南芥花瓣和雄蕊发育的重要转录因子。在拟南 芥花发育过程中，AP3基因的转录活性主要局限在第2和第3轮花器官中，在萼片原基出现 时开始表达，在花瓣和雄蕊原基发生后达到很高的表达水平，开花后，其表达开始下降。此 外，SUP基因能抑制AP3基因在雌蕊中的表达，确立花器官中AP3基因表达的内边界，而AP3 基因初期表达主要依赖LFY和UF0转录因子，后期表达主要受AP3/PI蛋白复合体影响。同 时，AP3同源基因演化是引起被子植物花瓣多样性的一个重要原因，其演化过程经历了一系 列复杂的亚功能和失去功能的事件。因此，AP3同源基因的功能分化与植物花瓣的多样性 密切相关。
[0004] 楸树为顶生伞状花序，花蕾是圆球形，花两性；开花时，花冠为2唇形，上唇2裂，下 唇3裂，下唇有两条黄色的脉纹和紫色斑点；雄蕊5枚，着生在花冠的基部，可育雄蕊2枚位 于花冠下唇内，退化的雄蕊3枚，着生在花冠上唇内。由于楸树花冠优美色艳，同时楸树花 器官发育过程中又存在雄蕊败育和自花不育的现象，因此开展与楸树花冠和雄蕊发育的分 子调控机制研究具有重要意义。
[0005] 目前已公布的AP3基因及其同源基因，多来源于模式植物或者草本植物，这些植 物多为一年生植物，花芽材料容易获得。而楸树作为多年生木本植物，树型高大挺拔，营养 生长周期长，花芽材料较难获得。同时，由于植物基因的非编码区（UTR)序列对目的基因是 不可缺少的，并对目的基因具有调控作用，且序列高度不保守，因此无法通过传统同源克隆 的方法获得。传统的同源克隆主要依靠保守的蛋白序列设计兼并引物，但是经常出现序列 同源性较差、不同生物的碱基使用偏好等原因，很难获得楸树的AP3同源基因。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种楸树CabuAP3蛋白及 其编码基因与应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种楸树CabuAP3蛋白，所述蛋白的氨基 酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0008] 本发明还提供了前述蛋白的编码基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0009] 本发明还提供了含有前述编码基因序列的载体。
[0010] 本发明还提供了所述载体的构建方法，包括如下步骤：
[0011] 所述载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0012] 将两端包含酶切位点的楸树CabuAP3蛋白的编码基因序列构建到pmdl8_T载 体上，转入大肠杆菌感受态细胞得到pmd18-CabuAP3重组质粒，双酶切pmd18-CabuAP3 重组质粒和PBI121质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体 PBI121-CabuAP3〇
[0013] 本发明还提供了含有所述载体的工程菌。
[0014] 本发明还提供了用于克隆前述编码基因序列的引物对，所述引物对包括：
[0015] CabuAP3-F:5' -CTCAAATCTAGAAAATCAATGGCTC-3' ；
[0016] CabuAPS-Rj' -GCGCCCGGGTTCATTTTATTCAAGC-3'。
[0017] 本发明还提供了一种楸树CabuAP3基因，其cDNA全长的核苷酸序列如SEQID No. 3所示。
[0018] 本发明还提供了楸树CabuAP3基因在改造植物花器官中的应用。
[0019] 具体为，通过农杆菌介导的花序浸染法将楸树CabuAP3基因或前述编码基因序列 转入植物中。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 本发明首次提供了楸树花瓣和雄蕊发育相关的CabuAP3蛋白及其编码基因与应 用。本发明提供的CabuAP3基因仅在楸树的花瓣和雄蕊中表达，而在叶片、萼片和雌蕊中不 表达。通过农杆菌介导的花序浸染法将CabuAP3基因表达载体转入野生型拟南芥和拟南芥 ap3-3突变体中，结果显示转基因野生型拟南芥额外长出了 1个花瓣，说明CabuAP3基因具 有调控转基因野生型拟南芥花瓣数量增加的新功能，而转基因拟南芥ap3_3突变体长出了 花丝状结构。利用楸树CabuAP3基因表达载体获得的植物变异材料，可用于植物育种和观 赏，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明所述楸树花瓣和雄蕊发育相关的CabuAP3基因cDNA的核苷酸序列 图。
[0023] 图2是本发明所述CabuAP3基因所编码的蛋白的氨基酸序列和结构域划分图。
[0024] 图3是本发明实施例1楸树花芽totalRNA的3'RACE和5'RACE电泳图。其中， a是 3'RACE的电泳图，M为DNAmarkerIII，1 为 3'RACEoutPCR产物，2 为 3'RACEinner PCR产物；b是 5'RACE的电泳图，M为DNAmarkerIII，l为 5'RACEoutPCR产物，2 为 5'RACE innerPCR产物；c为CabuAP3 基因CDS的PCR电泳图，M为DNA11^11?^111，1为含有〇31311八?3 基因⑶S的PCR产物。
[0025] 图4是本发明实施例3楸树CabuAP3基因组织特异性表达电泳图。
[0026] 图5是本发明实施例4楸树CabuAP3基因的植物转基因载体PBI121-CabuAP3构 建示意图。
[0027] 图6是本发明实施例6转基因前后的野生型拟南芥和拟南芥ap3_3突变体的花朵 照片。其中a是野生型拟南芥；b是转基因野生型拟南芥；c是拟南芥ap3_3突变体；d是转 基因拟南芥ap3-3突变体。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0029] 实施例中所使用的试剂主要包括分子生物学实验试剂和试剂盒等，均可通过商业 途径获得，具体包括：RNA提取试剂盒购自Aidlab生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒、质粒快速小提试剂盒和toplO大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技有限公司； 3'-fullRACECoreSetVer. 2.0 试剂盒和 5'-fullRACEKit试剂盒，M-MLV逆转录酶、 LA-taqDNA聚合酶、EX-taqDNA聚合酶、dNTP、pmdl8_T载体、XbaI和SmaI限制性内切 酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa(宝生物工程（大连））有限公司；DNAmarkerm购自中科 瑞泰（北京）生物科技有限公司；引物合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成； 测序工作均由华大基因科技股份有限公司完成。本发明实施例中所提供的方法如果没有特 殊说明均为常规方法。
[0030] 实施例1 一个楸树CabuAP3基因cDNA序列的克隆
[0031] 1、楸树花芽totalRNA的提取
[0032] 采集楸树新鲜的长度约5mm的花芽，放入冻存管中，立即放入液氮中快速冷冻 3h后，放入-80°C超低温冰箱中备用。使用RNA提取试剂盒提取楸树花芽的totalRNA: 从_80°C超低温冰箱中取出楸树花芽材料，放入加有2mLRLT裂解液和100yLPLANTaid 的研钵中，在室温下，充分研磨；将上述研磨液转移至2mL的eppendorf管中，13000rpm离 心10min后，吸取500yL上清液，转移到新的2mL离心管中；向上清夜加入250yL无水 酒精，吹打混匀；将上述液体转移至吸附柱中，并将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入 500yL漂洗液，13000rpm离