鲍曼不动杆菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用
【技术领域】
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本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种免疫保护性亚单位疫苗及其应用。
【背景技术】
[0002]
随着医药技术的飞速发展，特别是抗生素的广泛使用，使感染性疾病的救治水平得到不断的提高，但随之而来的是抗生素滥用现象的增多，在抗生素的强大压力下，产生了大量的耐药菌株，这些耐药菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。不动杆菌是近年来医院院内感染中分离率增长较快的菌种，其中鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, Ab)已成为临床最为常见的院内感染病原菌。
[0003]鲍曼感染可引发败血症、软组织或伤口感染、插管相关感染、尿路感染、菌血症、继发性脑膜炎等。鲍曼对危重患者威胁尤其严重，特别容易在重症监护病房(ICU)引起爆发流行，具有高的致死率。
[0004]鲍曼不动杆菌可引起严重临床危害的主要原因是:(I)鲍曼在医院环境中分布很广且可长期存活，主要存在人的皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，对湿热、紫外线、化学消毒剂有较强抵抗力，常规消毒剂只能抑制其生长而不能将其杀灭。(2)尤为重要的是，鲍曼耐药机制复杂，耐药性严重。近年来，许多省份均已出现鲍曼播散和流行。有研究表明:鲍曼主要是通过多种抗生素水解酶的表达、外膜通透屏障、药物主动外排栗等机制的协同作用而呈现多重耐药性。
[0005]鲍曼耐药性逐年增强，近年来甚至出现“全耐药”菌株，许多现有抗生素的治疗作用已不明显，给临床治疗带来了很大的难题。新的抗生素发展缓慢，且鲍曼耐药性适应迅速，因此，寻求新的解决方案显得极为重要。国内目前对鲍曼不动杆菌研究很大部分都集中于院内鲍曼耐药性的动态变化监测，或是耐药机制的研究。国外的研究主要从耐药机制，致病机理和耐药性的变化等方面入手，关于疫苗方面的研究主要集中在不动杆菌灭活的全菌，全外膜蛋白(OMPs)和外膜蛋白囊泡(OMVs)的免疫原性和保护性的研究上。Michael J.McConnell等人的研究结果表明，OMPs和OMVs免疫的小鼠能抵抗鲍曼的感染和侵袭，同时还证明小鼠接受抗血清被动免疫同样能抵抗鲍曼的感染和侵袭。
[0006]值得注意的是，鲍曼不动杆菌OMPs或OMVs由许多蛋白组成，而这些蛋白的分离和纯化是一个繁杂的过程，且产量很难得到提高，有效成分与大量无关蛋白及杂质混杂。虽然用OMPs或OMVs免疫相对于全菌免疫安全性上有所提高，但其中包含了菌体的很多外膜和细胞壁成分，包括LPS在内，仍会产生显著的毒副作用。
[0007]利用免疫信息学和反向遗传学，分析多重耐药不动杆菌外膜蛋白成分的抗原性及免疫原性，并进行基因克隆，蛋白表达、纯化，以及免疫学研究，筛选出有效的外膜蛋白成分，探讨鲍曼不动杆菌免疫控制策略的潜能，将提升疫苗的有效性和安全性，因而较之OMPs, OMVs或者全菌疫苗具有更加现实和诱人的应用前景。
【发明内容】
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将鲍曼不动杆菌菌株ATCC 17978在LB培养基中培养，培养至对数期时收集菌体，以菌体为模板进行PCR扩增，获得鲍曼不动杆菌ATCC 17978 OmpW的核酸序列(SEQ ID NO:1所示)，双酶切后以基因工程手段连入原核表达载体，将重组质粒转化进入大肠杆菌DH5 α后挑取阳性重组子，提取质粒进行测序鉴定。
[0009]将OmpW重组质粒转化进BL21 (DE3)感受态细胞，以IPTG诱导表达重组OmpW蛋白(SEQ ID NO:2所示)，表达产物经超声波破碎后收集包涵体并将其溶解、重折叠。
[0010]将重折叠后的蛋白以阳离子柱及亲和柱进行纯化后获得重组OmpW蛋白。
[0011]将该重组蛋白与氢氧化钠铝佐剂1:1混合后免疫小鼠，收集免疫后小鼠血清，进行ELISA检测抗鲍曼不动杆菌OMVs的特异性抗体滴度，发现经OmpW免疫后小鼠体内产生了较高的特异性抗体水平；并以该抗OmpW血清进行Western blot检测多株临床分离的鲍曼不动杆菌菌体蛋白，发现该抗体能特异性识别多株临床鲍曼不动杆菌菌体中的OmpW蛋白。
[0012]向小鼠腹腔注射临床分离的耐药鲍曼不动杆菌，连续观察一周，发现经OmpW免疫后的小鼠存活率为100%，对照组存活率仅为16.7%，同时在小鼠外周血、肝脏、肺、肾脏、脾脏中的细菌载量在疫苗组中较对照组降低了 14-1O6倍，且在血清中的炎症细胞因子水平显著降低，显示了该亚单位疫苗抗原具有较高的免疫保护性。
[0013]将OmpW免疫后小鼠的抗血清通过尾静脉注射进小鼠体内，再以临床分离的耐药鲍曼不动杆菌感染，发现被动免疫后的小鼠保持了 83.3%的存活率，而对照组仅为16.7%，在小鼠外周血、肝脏、肺、肾脏、脾脏中的细菌载量在疫苗组中较对照组降低了 12-1O3倍，且在血清中炎症细胞因子水平显著降低，显示了针对OmpW的抗血清具有被动免疫保护效果，在体内具有有效的杀菌活性。
[0014]经体外调理实验证明OmpW抗体具有体外调理杀伤活性，能起到调理素作用特异性杀伤多株临床分离的鲍曼不动杆菌，体现了 OmpW作为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗的广泛交叉保护性。
【附图说明】
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图1显示了鲍曼不动杆菌亚单位疫苗抗原OmpW的主动免疫及被动免疫程序，以及临床分离的鲍曼不动杆菌菌株的感染程序。
[0016]图2显示了融合表达的OmpW在BL21 (DE3)菌株中诱导表达前后的情况，及纯化后的蛋白情况，图片为考马斯亮蓝染色后全菌及纯化蛋白的SDS-PAGE分析。
[0017]图3显示了经亚单位疫苗抗原OmpW最后一次免疫后I周及3周后小鼠血清中特异性抗体的滴度水平(n=6)。
[0018]图4显示了以Western blot检测OmpW抗血清特异性识别临床分离的鲍曼不动杆菌菌株的情况，以抗鲍曼不动杆菌OMV (AbOMVs)抗体为阳性对照，对照血清为阴性对照。
[0019]图5显示了经OmpW主动免疫后，感染鲍曼不动杆菌的小鼠存活率情况(n=6)。
[0020]图6显示了经OmpW被动免疫后，感染鲍曼不动杆菌的小鼠存活率情况(n=6)。
[0021]图7显示了经OmpW主动免疫后，感染鲍曼不动杆菌的小鼠各器官载量情况(n=6)。
[0022]图8显示了经OmpW被动免疫后，感染鲍曼不动杆菌的小鼠各器官载量情况(n=6)。
[0023]图9显示了经OmpW主动免疫后，感染鲍曼不动杆菌的小鼠血清中炎症细胞因子分泌情况(n=6)。
[0024]图10显示了经OmpW被动免疫后，感染鲍曼不动杆菌的小鼠血清中炎症细胞因子分泌情况(n=6)。
[0025]图11显示了梯度稀释及热灭活补体后的抗OmpW血清的体外细菌杀伤活性，显示了该抗血清能有效杀伤鲍曼不动杆菌并依赖于巨噬细胞。
[0026]图12显示了抗OmpW血清对不同来源的临床分离菌株的体外调理杀伤情况。
[0027]SEQ ID NO:1为本发明中鲍曼不动杆菌外膜蛋白W (Ompff)的基因序列。
[0028]SEQ ID NO:2为本发明中鲍曼不动杆菌外膜蛋白W (Ompff)的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0029]
通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示范性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。
[0030]实施例
实施例1:鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpW原核表达质粒的构建
将鲍曼不动杆菌菌株ATCC 17978在LB培养基中过夜培养，待菌体生长至对数期(OD6qq=0.4-0.6)，取菌液进行 PCR 扩增，PCR 扩增引物为 OmpW-F (5’ GGATCC ATG GGG GTGTCT TCA TTT ACT T 3，)和 OmpW-R (5，GAATTC TTA GAA TTT ATA GCT ATA GCC T 3，)；PCR 体系具体为:菌液:2 μ L