专利名称：一种肺部感染药物评价方法
技术领域：
本发明属药物评价，涉及一种肺部感染药物评价方法，尤其涉及一种评价 鲍曼不动杆菌肺部感染药物的方法。
背景技术：
1. 鲍曼不动杆菌痰培养阳性率高，感染与定植难以鉴别
细菌感染性疾病在我国仍是常见病，由条件致病菌所致感染比例在不断上 升，严重威胁人类健康。鲍曼不动杆菌是医院感染重要条件致病菌。近年来， 鲍曼不动杆菌感染日益增多,其耐药性不断增加，给临床治疗带来了极大困难， 已引起临床医生和微生物工作者的高度关注。特别是美军在伊拉克和阿富汗军 事行动中，很多士兵爆发多重耐药鲍曼不动杆菌肺部感染，引起全世界的广泛 重视。根据美国院内感染监测数据以及中国院内感染病原菌调查显示,不动杆菌
属在医院内感染中占第4位，成为仅次于铜绿假单胞菌的又一个重要的非发酵 糖菌。它在免疫力低下的患者中,可以引起严重的、甚至致死性的感染，如呼吸 机相关肺炎(VAP)、败血症、泌尿系统感染、脑膜炎等。
近年来，亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌常在重症监护病房、血液病房、呼吸 科病房及老年病房等引起流行，尤其是肺部感染率高，治疗困难，病死率高， 临床迫切需要切实有效的抗感染治疗方案，迄今为止如何治疗仍是一个全球范 围的难题，同时对其致病机理也知之甚少。
目前，有关鲍曼不动杆菌致病机理研究报道罕见，而且有一个非常棘手的 问题一直困扰着临床从呼吸道分离的鲍曼不动杆菌到底是感染菌还是定植菌 难以鉴别。因此，有必要对鲍曼不动杆菌的致病性进行深入研究，尤其是亚胺 培南耐药鲍曼不动杆菌的致病机理更应该全面系统地加以研究。
2. 当前鲍曼不动杆菌肺部感染研究缺乏理想的动物模型 动物实验是研究鲍曼不动杆菌的致病性和抗感染治疗最有效的途径之一，
在鉴别肺部分离的鲍曼不动杆菌的感染与定植方面意义重大。然而，鲍曼不动 杆菌肺部感染的动物模型国外报道罕见(仅见手术插管法和滴鼻法)，国内还 未见相关模型报道。由于动物的差异、感染菌量的多小、感染的途径不同等原因，该菌肺部感染动物模型的差异较大，手术插管法鲍曼不动杆菌肺部感染小 鼠模型制备由于技术要求很高、费时费力、可操作性重复性差，成功率低，该
模型应用极少；滴鼻法影响因素多，模型成功率低，其他建立鲍曼不动杆菌肺 部感染模型的方法，因实用性差而被淘汰。因此，目前没有实用的鲍曼不动杆 菌肺部感染动物模型。
3.鲍曼不动杆菌肺部感染动物模型制备的迫切性
鉴于临床鲍曼不动杆菌肺部感染的高发和实验研究用动物模型的缺失，目 前，迫切需要建立一种稳定可控、简单实用、经济便捷、可操作性好、重复性 高的鲍曼不动杆菌肺部感染动物模型，以解决定植与感染的鉴别诊断问题，并 顺利开展亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌肺部感染致病机制及治疗方法等的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种肺部感染药物的评价方法，通过一下步骤实现
(1) 建立模型采用超声雾化法，分别将160只体重13-14g的SPF级雄 性BALB/C小鼠随机分成4组模型组(注射甲氨蝶呤降低免疫力后超声雾化 给菌)40只，对照组3组(对照1组免疫力正常小鼠超声雾化给菌组；对照 2组注射甲氨蝶呤降低免疫力后超声雾化给生理盐水组；对照3组免疫力 正常小鼠超声雾化给生理盐水组)各40只，各小鼠麻醉后，模型组采用医用 超声雾化器将鲍曼不动杆菌菌液雾化，经呼吸道感染小鼠，对照2组和3组采 用超声雾化给生理盐水，对照1组超声雾化给菌；
(2) 细菌培养造模完成后，各组小鼠分笼正常喂养，并分别在0h、 4h、 8h 、 12h、 24h、 48h、 72h观察各组小鼠基本情况，同时随机取2只进行麻醉 处死，取肺进行细菌定量培养、病理学检查，
(3) 综合评价最后以不同感染时间小鼠的一般情况、病理变化、肺部 细菌数量变化等多项指标进行综合评价。
本发明制备的鲍曼不动杆菌肺部感染小鼠模型的评价方法包括小鼠一般 情况的观察、肺部细菌定量培养、肺部病理学观察等，所有评价方法均为常规 方法，操作简单，可行性强。评价结果表明，模型组小鼠在感染细菌4-8h后全 部出现感染症状，24h 48h死亡l只小鼠，48h后死亡l只小鼠，7天后全部恢复 正常，感染率为100%，对照组未见到明显感染症状，无小鼠死亡。
病理变化包括模型组小鼠在感染细菌后4-12h肺部组织可见炎症细胞浸 润，12-24h支气管周及肺泡间质内见中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞为主的 炎症细胞浸润，并伴淤血水肿等炎症反应，24-48h肺部炎症反应加重，可见小脓肿，48h后炎症逐渐恢复，72h基本恢复。对照组小鼠肺部各时间段均未见明 显病理变化。
本发明方法的特点是所用BALB/C小鼠鼠龄和体重小，在细菌感染前采用 化疗方法对小鼠进行前处理以降低小鼠免疫力，同时，首次采用超声雾化法经 呼吸道感染BALB/C小鼠，以制备鲍曼不动杆菌肺部感染小鼠模型，为临床研 究鲍曼不动杆菌肺部感染致病机制及治疗方法等提供了理想的动物模型。
医用超声雾化器能将药液雾化，并通过波纹管将药物送入病人呼吸道或创 面进行治疗，对鼻炎、咽炎、急慢性支气管炎、肺部感染、哮喘、肺气肿等症有 显著疗效。该仪器功能特点使用方便，自由调节雾化量大小，可以定时定量， 安全可控。我们在雾化器药杯中盛放菌液，对菌液进行雾化，而且经检验超声 雾化对细菌活力等没有任何影响。麻醉小鼠通过呼吸道均匀吸入细菌，跟临床 的感染途径相似，所建立的感染模型可以模拟鲍曼不动杆菌肺部感染的整个致 病过程，可行性强，实用性高。
BALB/C小鼠为近交系小鼠，有着高度相似的遗传背景，这也保证了模型 的稳定性。本发明方法中所需要的医用超声雾化器一般医药公司均有销售， BALB/C小鼠可以从浙江省实验动物中心或其他符合国家标准的实验动物中心 购买，实验过程中需要的II级生物安全柜一般实验室都有配置，两端开口塑料 容器(雾化桶)市面有售，实验在II级生物安全柜中进行，小鼠一般喂养在实 验动物中心清洁级屏障系统实验室，也可以在相对封闭的实验室喂养观察。
本发明采用超声雾化法建立的鲍曼不动杆菌肺部感染小鼠模型可以模拟 临床肺部感染的整个过程，实用性强，重复性、可靠性、适用性和可控性均较 高、最关键的是该法建立的肺部感染模型操作简单，可以同时大批量操作，各 模型小鼠间差异很小。因此，超声雾化法制备的小鼠肺部感染模型具有模型稳 定性好、与临床致病过程相似度高、成模速度快等优点，为鲍曼不动杆菌肺部 感染致病机制及治疗方法等的研究提供了理想动物模型。
图1是不同时间段小鼠肺部感染细菌数。
图2是小鼠感染细菌0h的肺部病理图片(HE染色xlOO):肺泡组织结构 清晰，间质未见炎症，血管轻度淤血扩张(小鼠处死后正常生化反应)。
图3是小鼠感染细菌4h的肺部病理图片(HE染色x400):肺泡腔完整， 结构清晰，支气管腔周围见少量炎症细胞。
图4是小鼠感染细菌8h的肺部病理图片(HE染色x40):肺泡组织结构清晰，间质未见炎症，肺泡腔周围见炎症细胞浸润。
图5是小鼠感染细菌12h的肺部病理图片(HE染色xl00):支气管周及肺 泡间质内见中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞为主的炎症细胞浸润。
图6是小鼠感染细菌24h的肺部病理图片(HE染色x400):肺泡腔及间质 内可见化脓性炎症细胞和坏死，部分区域存在细胞变性。
图7是小鼠感染细菌48h的肺部病理图片(HE染色x400):肺泡腔及间质 内可见化脓性炎症细胞和坏死气管和支气管周围变性，部分肺组织血管高度扩 张，伴有水肿。
图8是小鼠感染细菌72h的肺部病理图片(HE染色xl00):支气管及肺泡 组织结构基本清晰，间质内可见慢性炎症细胞浸润。
图9是小鼠感染细菌自然死亡的肺部病理图片(HE染色xlOO):支气管腔 见出血及细菌集落，周围肺组织可见坏死、出血和脓肿改变。
具体实施例方式
本发明结合附图和具体实施方式
做进一步的说明。
实施例1
1. 材料
1.1菌株来源实验用亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌分离自浙江大学医学院
附属第一医院痰标本，并经WITEK-II和OXA-51-like基因测序鉴定。
1.2.培养基血平板，法国梅里埃公司生产，M-H琼脂，哥伦比亚公司生产。
1.3实验药物注射用甲氨蝶呤江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号 07072812;
1.4. 实验动物SPF级BALB/C小鼠，鼠龄4-5周，体重13-14g，雄性， 购自浙江省实验动物中心，合格证号SCXK (浙)2003-0001。
1.5. 仪器设备超声雾化器，江苏鱼跃医疗器械有限公司，VITEK-AMS 自动化微生物分析仪。SW-II-A/B3生物安全柜上海上净净化设备有限公司。 两端开口雾化塑料桶，超市购得。细菌菌液置雾化杯中，含菌气体随波纹管出 口进入雾化桶中，麻醉小鼠吸入含菌气体，雾化桶另一小出口排出气体。
2. 方法
2.1甲氨蝶呤半数致死量(LD5())须U定(为降低小鼠力免疫选择合适剂量) 将50只13-14g的SPF级雄性BALB/C小鼠随机分成5组，每组10只， 各组小鼠每日一次经腹腔注射甲氨蝶呤0.1mg (以体表面积换算关系，人鼠用药比为0.0026) ， 0.2mg， 0.5mg， l.Omg， 1.5mg，每次注身寸体积为0.2ml,连 续注射2天，正常喂养，7天后统计各组小鼠的死亡率。
2.2动物分组(免疫力低下指腹腔注射甲氨蝶呤0.4mg，免疫力正常指腹 腔注射注射用水0.4ml)
将160只体重13-14g的SPF级雄性BALB/C小鼠随机分成4组模型组 (免疫力低下小鼠超声雾化给菌)40只，对照组3组各40只(对照l组免 疫力正常小鼠超声雾化给菌组；对照2组免疫力低下小鼠超声雾化给水组； 对照3组免疫力正常小鼠超声雾化给水组)。各小鼠麻醉后，模型组采用医 用超声雾化器将鲍曼不动杆菌菌液雾化，经呼吸道感染小鼠，对照2组和3组 超声雾化给生理盐水，对照1组超声雾化给菌。造模后分笼隔离正常喂养，并 进行后续研究。
2.3造模方法(超声雾化方法)
将所有小鼠麻醉后，分别置雾化桶中，然后将培养10h的鲍曼不动杆菌用 增菌液配置成108cfb/L的菌液100ml，置雾化器药杯中，安装好雾化器，将其 波纹管出口接入雾化桶中，最后将雾化器和雾化桶一同放入安全柜中，开启雾 化器，以2ml/min雾化速度雾化30min。
2.4标本采集与处理
造模完成后，各组小鼠分笼正常喂养，分别在Oh、 4h、 8h 、 12h、 24h、 48h、 72h观察各组小鼠基本情况，各组随机取2只进行麻醉处死，无菌操作将 小鼠的肺取出,将左肺放入无菌的玻璃组织碾磨器中，加入2 ml无菌PBS进行 碾磨，使细菌完全进入悬浮液中，将悬浮液倍比稀释，各取10pl接种无菌平板 中，然后将M-H琼脂20ml倾注平板中，立即混匀37'C培养18h，计数平板细 菌数，最后计算每只小鼠肺内细菌总数，计算其对数值；同时将右肺置10%甲 醛固定，石蜡包埋，病理切片，HE染色，用显微镜观察肺组织的炎症反应和 病理改变。
2.5检测指标
(1) 一般情况包括小鼠饮食、活动情况、精神、呼吸、是否咳喘等； (2)细菌清除率定量检测各组小鼠不同时间段肺部细菌数。(3)肺部病理 学观察不同组别、不同时间段小鼠肺部炎症反应情况。 3.结果
3.1甲氨蝶呤半数致死量和最小致死量
甲氨蝶呤各剂量组小鼠的死亡数为0.4mg及以下剂量小鼠未见死亡，1.0mg组7只死亡，2.0mg组全部死亡，根据Reed-Muench法计算出甲氨蝶呤对 小鼠的半数致死量(LD5())为0.48mg，最小致死量为1.0mg。 3.2 —般情况
各组小鼠在早期均无明显变化，模型组小鼠在感染细菌4-8h后全部出现 感染症状，包括呼吸急促、咳喘，活动减弱等，16h症状加重(几乎蜷縮不动， 不吃不喝)，感染率为100%， 24h-48h死亡l只，48h后死亡l只，48h小鼠 咳喘频率下降，但仍然不动，72h后逐渐恢复，7天后全部恢复正常，对照各 组小鼠均未见明显变化。
3.3细菌清除率
模型组小鼠肺部细菌都在感染8h-12h内数量增加，24h达到平衡，48h后 细菌数量开始下降，对照l组小鼠肺部细菌很快就被清除，其余2组小鼠肺部 均未检测到鲍曼不动杆菌(见图1)。
3.4病理变化
模型组小鼠在感染4-12h肺部组织的炎症细胞浸润较少，在感染12h-24h 支气管周及肺泡间质内见中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞为主的炎症细胞浸 润，24h见肺部部分区域存在细胞变性,支气管及肺泡组织可见小脓肿，肺泡壁 血管轻度扩张伴淤血，24h-48h可见气管和支气管周围变性，部分肺组织血管 高度扩张，伴有水肿和小脓肿，48h后炎症逐渐恢复。对照l组小鼠在细菌感 染4h-24h肺部组织有轻微的炎症反应，主要见少量炎症细胞浸润(以淋巴细胞 为主，伴有少量的中性粒细胞和巨噬细胞)，24h-48h后炎症反应基本消失。对 照组另两组小鼠肺部未见炎症反应。肺部病理图片参见图2—9。
权利要求
1.一种肺部感染药物评价方法，其特征在于，通过以下步骤实现(1)建立模型采用超声雾化法，将SPF级雄性BALB/C小鼠随机分成1组模型组和3组对照组，模型组经甲氨蝶呤降低免疫力后超声雾化给菌，对照1组直接超声雾化给菌，对照2组经甲氨蝶呤降低免疫力后超声雾化给生理盐水组，对照3组直接超声雾化给生理盐水组；(2)细菌培养分别在0小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时观察各组小鼠基本情况，取细菌定量培养；(3)综合评价按照步骤(2)不同感染时间进行病理学检查，并结合小鼠一般情况、炎症反应、病理变化、肺部细菌数量指标综合评价。
2. 根据权利要求l所述的一种肺部感染药物评价方法，其特征在于，步骤(2) 所述基本情况包括小鼠饮食、活动情况、精神、呼吸、咳喘症状。
3. 根据权利要求l所述的一种肺部感染药物评价方法，其特征在于，步骤(3) 用显微镜观察肺组织的炎症反应和病理改变。
全文摘要
本发明提供一种肺部感染药物的评价方法，通过超声雾化法建立鲍曼不动杆菌肺部感染模型，进行细菌定量培养、病理学检查，以不同感染时间小鼠的一般情况、病理变化、肺部细菌数量变化等多项指标进行综合评价。本发明提供的药物评价方法，实用性强，模型的重复性、可靠性、适用性和可控性均很高，最关键的是该法建立的模型操作简单，可以同时大批量操作，各模型小鼠间差异很小，模型稳定性好，与临床致病过程相似度高、成模速度快等优点，为研究鲍曼不动杆菌肺部感染致病机制及筛选治疗药物提供依据。
文档编号A61K35/66GK101606953SQ20091010032
公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者余道军, 俞云松 申请人:浙江大学;杭州市第一人民医院