Ace抑制肽及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及ACE抑制肽及其应用。
【背景技术】：
[0002] 高血压是全球最常见的慢性病，是导致心血管病和肾脏病等发生以及死亡的 最主要危害因素。人体的血压调节主要是受到血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS)和激肽系统（kallikreinkininsystem，KKS)控制，而血管紧张素转化酶 (Angiotensinconvertingenzyme，ACE)在这两个系统中起着关键作用。ACE是一种羧基 二肽酶，广泛分布于哺乳动物的组织中，主要以膜结合胞外酶的形式存在于血管上皮细胞。 在RAS系统中，ACE能够使没有生理活性的血管紧张素I(AngiotensinI，AngI)转化 为具有升压活性的血管紧张素II(AngiotensinII，AngII)。在KKS系统中，ACE可将血管 舒缓激肽降解为失活片段，导致血管收缩，引起血压升高。目前高血压的药物治疗主要是对 ACE进行抑制，阿利吉仑、卡托普利、依那普利、阿拉普利和赖诺普利都是广泛应用的抗高血 压药物。然而，这些药物会引发诸如咳嗽、过敏、味觉紊乱和皮疹等副作用，因此，寻找安全 可靠、毒副作用小的ACE抑制剂成为抗高血压药物研究的热点。
[0003] 近年来，相关研究表明一些从动物、植物以及乳制品中分离得到的天然生物活性 肽具有抑制ACE活性、降低血压的作用。相比传统降压药物这些天然活性肽具有特异性高、 毒副作用小、疗效好、可用药剂量更大等优点。在这其中二肽和三肽可以在小肽转运蛋白 (peptidetransporter)的帮助下被肠粘膜完整的吸收，因此，这些二肽和三肽对ACE的抑 制作用以及降压效果也较为明显。目前尚未有研究对二肽的氨基酸构成以及其ACE抑制活 性进行系统的分析研究。
【发明内容】
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[0004] 本发明的第一个目的是提供对ACE(血管紧张素转化酶）的活性具有持续稳定的 抑制作用，具有良好降血压效果的ACE抑制肽。
[0005] 本发明的ACE抑制肽，其氨基酸序列为CA(Cys_Ala，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1 所示）或CH(CyS-His，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示）。
[0006] 本发明的第二个目的是提供上述ACE抑制肽在制备ACE抑制药物中的应用。
[0007] -种ACE抑制药物，其含有上述ACE抑制肽作为活性成份。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用。
[0009] -种降血压药物，其含有上述ACE抑制肽作为活性成份。
[0010] 本发明的二肽CA或CH对ACE的活性具有持续稳定的抑制作用，并经动物试验发 现，二肽CA在大鼠体内具有良好的降血压效果，为合成高血压治疗药物提供参考。
【附图说明】：
[0011] 图1是二肽CA和CH的ACE抑制活性；
[0012] 图2是CA灌胃后2小时SHR大鼠血压改变情况。血压变化数据以"平均值土标 准误"形式表示。*P〈〇. 05, **p〈0. 01表示给药前后血压发生显著变化；
[0013] 图3是CA灌胃后4小时SHR大鼠血压改变情况。血压变化数据以"平均值土标 准误"形式表示。*P〈〇. 05, **p〈0. 01表示给药前后血压发生显著变化；
[0014] 图4是灌胃后2小时SHR大鼠SBP随CA剂量增加呈线性下降趋势。
【具体实施方式】：
[0015] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0016] 实施例1 :
[0017] 1?实验部分
[0018] 1.1实验材料和仪器
[0019]实验材料：35种合成二肽（由吉尔生化上海有限公司合成）、卡托普 利（Captoril)、呋喃丙烯酰三肽（FAPhe-Gly-Gly，FAPGG)、ACE、原发性高血压大鼠 (SpontaneouslyHypertensiveRats，SHR)、生理盐水
[0020] 仪器设备：酶标仪、移液器、大小鼠无创血压仪，注射器，灌胃针，SPF实验室
[0021] 1.2实验方法：
[0022] 1. 2. 1ACE抑制率的测定
[0023] 二肽的ACE抑制率使用可见分光光度法进行测定。具体方法是利用FAPGG作为ACE 作用的底物，FAPGG最大吸收峰在340nm附近，用ACE将FAPGG水解成FAP和GG可使340nm 附近处吸光度降低，降低的速率与ACE活性成正比。通过测定FAPGG在340nm附近处吸光 度下降速度可计算出ACE的活性，进而根据添加抑制剂前后ACE酶活的变化间接反映不同 ACE抑制剂的抑制活性。本实验将二肽样本用超纯水溶解后配置20mg/mL原液，然后稀释 成20yg/mL浓度的样品作为实验组，以0. 002yg/mL的卡托普利溶液为阳性对照，以生理 盐水为阴性对照。实验于37°C下，以340nm为主波长，405nm为参比波长，检测吸光度值的 变化，连续检测1小时。根据公式：
计算样品的抑制率。其中E为 样品孔的ACE酶活（U/L)，计算公式为
；\为样品孔ACE动力学曲线直线段 的斜率，Sp为未加抑制剂孔的ACE动力学曲线直线段的斜率，Sb为空白孔ACE动力学曲线 直线段的斜率。
[0024] 1.2. 2大鼠降压实验
[0025] 购买31周龄的原发性高血压大鼠，饲养一周适应环境后进行分组实验。按照如 下剂量：卡托普利（l〇〇mg/kg)、生理盐水、CA(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、10mg/kg、lmg/ kg)将相应药品溶于生理盐水中利用灌胃方式进行给药。利用无创血压仪分别测量大鼠灌 胃前、灌胃后2小时、灌胃后4小时后的舒张压（DiastolicBloodPressure，DBP)、收缩压 (SystolicBloodPressure，SBP)和平均动脉压（MeanBloodPressure，MBP)，取其平均值 作为相应的血压值。
[0026] 1. 2. 3统计分析
[0027] 数据统计采用R进行两样本均值单尾t检验，数值均以均值土标准误表示。
[0028] 2?结果与讨论
[0029] 2. 1 35种二肽的ACE抑制率
[0030] 本研究用可见光分光光度法连续监测35种二肽在一小时内对ACE的抑制活性，结 果发现除IL、IV和KD外，其余32种二肽都对ACE有不同程度的抑制（表1)，在这其中CA 和CH的ACE的抑制率分别达到了 84. 38%和70. 79% (图1)，显著高于其他二肽。
[0031] 表1 35种二肽的ACE的抑制率
[0032]
[0033]
[0034] 如图1所示1小时连续检测发现CA和CH对ACE的活性有持续稳定的抑制作用， 其抑制效果与〇. 002yg/mL的卡托普利的作用效果相近。
[0035] 2. 2CA和CH1(：5。测定
[0036] 研究对二肽CA和CH的ACE抑制活性进行更加精确的测定，浓度梯度实验结果显 示CA的IC5。值为 23. 22yM，CH的 1C5。值为 61. 17yM。
[0037] 2. 3CA体内降血压实验
[0038] 相关研究表明部分ACE抑制剂的ACE抑制活性与实际降血压作用之间存在出入， 因此，体外检测所得到的具有高ACE抑制率的二肽是否能在生物体内拥有好的降血压效果 还需要进一步的动物实验来验证。在本研究中我们选用CA进行SHR大鼠降血压实验。用 CA、生理盐水和卡托普利对SHR大鼠进行灌胃，并分别于给药后2小时、4小时监测大鼠的血 压变化。
[0039] 如图2所示当CA剂量为lmg/kg时，给药后2小时SHR大鼠血压无明显 改变；当CA剂量达到10mg/kg时SHR大鼠血压开始呈下降趋势，其中SBP下降 16. 1±4. 73mmHg(p〈0. 05)，下降较为明显。随着CA剂量不断提高，给药后2小时SHR大鼠 血压下降幅度进一步增大，当CA剂量达到100mg/kg时SBP下降49. 26± 10. 42mmHg，DBP下 降45. 58±9. 27mmHg，MBP下降47. 01 ±9. 64mmHg，各指标均显著低于给药前（p〈0. 01)，降压 效果与同等浓度的卡托普利持平。
[0040] 我们在给药后4小时继续检测SHR大鼠血压变化。发现当CA剂量为10mg/kg时 给药后4小时降压作用基本消失（图3)。而当CA剂量达到25mg/kg时，其降压效果则要优 于给药后2小时。以SBP为例，用25mg/kg的CA灌胃SHR大鼠后4小时的SBP比给药前下 降 50. 86±3. 16mmHg(p〈0. 01)，比给药后 2 小时下降 27. 67±11. 02mmHg(p= 0? 09);当CA 浓度达到50mg/kg和100mg/kg时给药后4小时各血压指标血压也较给药后2小时低。DBP 和MBP的变化与SBP-致。
[0041] 由图2和图3可以看出SBP、DBP、MBP下降幅度随着CA剂量的增加整体呈上升趋 势。但我们发现灌胃后2小时以上各指标下降值与CA剂量呈很好的正相关，而在灌胃后4 小时以上各指标变化值与CA剂量呈非线性关系。利用pearson相关系数分析CA剂量与血 压指标灌胃前后的改变量之间的相关性，得到CA对应的各项指标的相关系数。如表2所示， CA灌胃后2小时的各项血压指标的平均改变量与剂量的相关系数R2>0. 8,说明CA急性药效 与剂量呈线性正相关，CA急性药效的研究适宜在灌胃后2小时进行采样。图4反映了SHR 大鼠给药后2小时SBP下降幅度随CA剂量增加呈线性增长。以上结果同时显示当CA剂量 达到25mg/kg后，给药后4小时SHR大鼠血压下降幅度不再随剂量增加发生明显改变，SBP 下降水平维持在50mmHg左右。
[0042]
[0043] 针对生物活性肽降血压效果的研究曾显示，不同长度的短肽在SHR大鼠体内的有 效作用时间不同。二肽和三肽（如：IW、VW、LW、IY及LKP)因为较容易被肠粘膜完整的吸 收，其达到最大药效的时间一般在给药后2小时左右，当时间超过2小时后其降压效果就逐 步降低。而相对长一些的LKPNM、LVGRPRHQG和卡托普利的最大药效时间则是在给药后4~ 8小时不等。在本研究中我们发现CA在给药4小时后的降压效果优于给药后2小时。分析 其原因可能与CA在体内吸收相较其他二肽更慢，或作用半衰期更长有关。
[0044] 此外，从植物、动物或奶制品中分离得到的具有高ACE抑制活性的生物肽C端多为 色氨酸（W)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)和脯氨酸（P)，而N端多为脂肪类支链氨基酸如缬氨 酸（V)和异亮氨酸（I)。氨基酸的构成与短肽和ACE的亲和能力紧密相关。而在本研究中 我们对35种二肽进行了系统的筛选，发现仅有的两个N端为半胱氨酸的二肽CA和CH的 ACE抑制活性明显高于其他二肽。提示N端为Cys同样有利于二肽和ACE结合，从而提高短 肽的ACE抑制活性。这一发现为进一步的生物活性肽的降压研究提供了新的线索。
【主权项】
1. ACE抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列为CA或CH。2. 权利要求1所述的ACE抑制肽在制备ACE抑制药物中的应用。3. -种ACE抑制药物，其特征在于，含有权利要求1所述的ACE抑制肽作为活性成份。4. 权利要求1所述的ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用。5. -种降血压药物，其特征在于，含有权利要求1所述的ACE抑制肽作为活性成份。
【专利摘要】本发明公开了ACE抑制肽及其应用。所述的ACE抑制肽，其氨基酸序列为CA或CH。本发明的二肽CA或CH对ACE的活性具有持续稳定的抑制作用，并经动物试验发现，二肽CA在大鼠体内具有良好的降血压效果，为合成高血压治疗药物提供参考。
【IPC分类】A61K38/05, A61P9/12, C07K5/062
【公开号】CN105111279
【申请号】CN201510465867
【发明人】潘武广, 朱威
【申请人】广州世优生物科技有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月30日