具有镇痛作用并抑制asic通道的新型肽的制作方法

专利名称：具有镇痛作用并抑制asic通道的新型肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及引起痛觉缺失并抑制ASIC通道(酸敏感离子通道)、更具体地包含选自ASICla和ASIClb的至少一种亚基的同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道和/或异聚体通道的新型肽，涉及编码所述肽的多核苷酸，还涉及包含其的药物组合物、宿主细胞和载体。具体地，所述肽展现与所附序列表中的氨基酸序列SEQ ID No:1至少56%的同一性。具体地，它们是从蛇黑树眼镜蛇(Dendroaspis polylepis)(黑曼巴蛇)的毒液分离的两种57 个氨基酸的肽 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2)，序列分别为 SEQ ID No:2 和 SEQ ID No:3o本发明还涉及其用于获得诊断工具或药物、具体地镇痛剂、和用于鉴定镇痛剂分子或抑制ASIC通道的分子的用途。具体地，本发明在预防或治疗疼痛、尤其是牵涉ASIC通道的活化的疼痛(例如炎症性疼痛、神经病性疼痛、癌症相关疼痛、手术后疼痛、肌肉骨骼痛、内脏痛等疼痛)、中枢神经疾病(例如，创伤后应激、抑郁、焦虑、中风、癫痫、多发性硬化、大脑炎症、神经退行性疾病等)、和其中已经提出牵涉ASIC通道的病理状况(例如，炎症、癌症、纤维肌痛、过敏性肠综合征等)方面具有应用。在以下说明书中，方括号([])中的参考文献是指在说明书末尾展示的参考文献的列表。现有技术水平疼痛的考虑和治疗是改进患者生活质量的必要方面。疼痛影响可观数目的个体，每年欧洲约6000万人，这代表用于 治疗所述疼痛的镇痛剂药物的每年10亿美元的开销。每年全世界花在镇痛剂药物上的总额可评估为大约250亿美元，在2010年应达到420亿美元。疼痛分为两类:急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛对应时间有限的快速和短暂疼痛。相反地，慢性疼痛是持续的疼痛，可以与例如痛觉增敏关联，并构成巨大的疾病负担，影响大约20 %的成年人和50 %的年长人群。疼痛的治疗基本上是基于抗炎药的处方，无论抗炎药是非类固醇抗炎药(NSAID)还是类固醇抗炎药(肾上腺皮质激素)，以及弱的或是强的阿片。NSAID由于其对炎症和对疼痛本身的大的效力，成为全世界最广泛开处方的治疗剂种类。它们用在所有类型的炎性疼痛中，无论是急性还是慢性的[Bertin和Vergne-Salle，2007] [I]。当NSAID和/或肾上腺皮质激素不足以缓解炎性疼痛时，开处方的医师组合非抗炎性镇痛剂，例如扑热息痛、弱的阿片样物质(opioid)(可待因、曲马多)，如果疼痛继续对治疗耐受，则组合强的阿片样物质(吗啡、氧可酮、芬太尼)[Gutstein & Akil, 2006] [2]。尽管NSAID非常有效，然而它们仍然是不利副作用的主要提供者。在最标准的不利副作用之中，消化影响是非常常见的并限制NSAID在许多临床情况中的应用。还存在肾、皮肤、粘膜、变应性和呼吸、血液学、肝以及最后感觉神经和心理学不利副作用[Bertin和Vergne-Salle，2007，上述][I]。此外，NSAID并非对所有类型的疼痛有效。阿片样物质也在对抗疼痛中起主要作用，但会导致幻觉现象和心肺衰减(cardiorespiratorydepression)。镇痛剂还可以是依赖性的来源,例如吗啡、美沙酮等的依赖性。还存在习惯镇痛剂的情形，即获得恒定作用必需的剂量必须增加。这一习惯随着时间增加，因此导致增加剂量的需要，并可导致药物无效。事实上，缓解疼痛必需的剂量可以变得大于所述药物的毒性剂量。最后，用阿片样物质治疗还可以伴有不利作用，诸如严重便秘或治疗停止时痛觉增敏(例如手术后疼痛)[Gutstein & Akil, 2006,上述；Bannister & Dickenson, 2010] [2,3] ο尽管现有治疗剂库的多样性，许多类型的疼痛仍然对已知镇痛剂相对不敏感，诸如神经系统损伤后的神经病性疼痛(50%的患者未经历缓解)、慢性内脏疼痛诸如过敏性肠综合征或慢性炎性肠病、纤维肌痛、癌症和骨转移带来的疼痛等。[Yennurajalingam等，2004 ；Mizoguchi 等，2009] [4，5]。因此在这一背景下，补偿这些不足和缺陷的新型镇痛剂和/或新型镇痛剂靶的发现应代表真正的进展。制药工业对疼痛的研究在过去数年仅获得数个有限的发展。可提及例如，用于偏头痛的曲坦类、和其用途仍然有限的某些新型药物，诸如用于癌症相关的疼痛和神经病性疼痛的四氢大麻酚和大麻二酚的组合。事实上，过去二十年取得的进展基本上来自于可获得的镇痛剂的更好用途和剂量的调整。由于有限的效力和/或显著的副作用，这些镇痛剂的主要家族都不具有最佳的益处/风险比。在过去数年鉴定的分子靶之中，离子通道占据特别重要的位置，因为它们直接参与感觉和中枢神经元对疼痛信号的检测和传递。ASIC通道(酸敏感离子通道)是由细胞外介质的酸化(细胞外酸中毒)活化的阳离子通道[Waldmann & Lazdunski, 1998 ；ffemmie等，2006 ;Lingueglia等，2007] [6，7，8]。迄今已经在哺乳动物中鉴定了编码至少七种亚基(ASICla、ASIClb、ASIClb2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3 和 ASIC4)的四种基因。不同 ASIC亚基缔合为三聚体产生功能性ASIC通道[Jast`i等2007] [9]，导致同聚体或异聚体通道[Lingueglia 等，1997 ；Benson 等，2002 ；Hesselager 等，2004] [10,11,12]。ASIC 通道基本上在外周神经系统的感受伤害的感觉神经元和中枢神经系统神经元中表达[Waldmann等，1997a ;Lingueglia 等，2007，上述；Noel 等，2010] [13，8，14]。尽管 ASICla 和 ASIC2 同种型在中枢神经系统和外周神经系统二者中都存在，但ASIClb和ASIC3同种型的表达限于感觉神经兀[Waldmann 等，1997b ；Bassler 等，2001 ；Chen 等，1998] [15,16,17]。已经假设，由感觉神经元表达的ASIC通道、尤其是ASIC3通道，能够检测缺血、炎症、血肿、骨折、病变、手术程序(手术后疼痛)、或某些肿瘤发展期间可能发展的细胞外酸化[Reeh和Steen，1996] [18]。当其发生时，多年来已经已知细胞外酸中毒导致疼痛[Steen等，1995a ；Issberner等，1996] [19, 20],而且对健康人类志愿者进行的实验[Ugawa等，2002 Jones等，2004] [21，22]借助为ASIC通道的非特异性抑制剂的阿米洛利和某些NSAID已经显示ASIC通道牵涉在酸性皮肤疼痛中[Waldmann等，1997a，上述；Voilley等，2001] [13，23]。还已经证实了中枢神经系统神经元中表达的某些ASIC通道在神经元活性(海马、杏仁核的突触可塑性)和脊髓神经元传递疼痛信息(ASICla通道)的神经调节中的重要作用[Noel 等，2010] [14]。直到最近，能够抑制ASIC通道的活性配体的清单主要限于阿米洛利、某些NSAID和化合物A-317567 [Dube等，2005] [24]。然而，这些分子都不是对ASIC通道或对特定ASIC亚基绝对特异性的。为了鉴定对ASIC通道特异性的效应物，已经筛选了非常大量的蝎子、蜜蜂、蜘蛛、蛇或海葵毒液。最近，已经鉴定了分别抑制同聚体ASICla通道和包含ASIC3亚基的通道的两种动物肽毒素PcTxl和APETx2 [Escoubas等，2000 ；Diochot等，2004] [25，26]。外周(皮下)注射APETx2引起大鼠中对炎性和酸性疼痛的镇痛作用[Deval等，2008][27]，和对手术中施加APETx2后大鼠的手术后疼痛的镇痛作用[Deval等，J.Neurosc1.，31(16) =6059-6066,2011] [36]，而中枢注射PcTxl在小鼠中引起强有力的镇痛作用[Mazzuca等，2007] [28]。这两种毒素的镇痛作用使得有可能证实ASIC通道在疼痛信息的感知和传递中的牵涉。因此对鉴定对ASIC通道或对特定ASIC亚基特异性、能够展现镇痛作用而同时补偿现有技术镇痛剂的不足、缺陷和障碍的其他效应物存在实际的需要。

发明内容
发明人现在已经从蛇黑树眼镜蛇(黑曼巴蛇)的毒液发现和鉴定出引起痛觉缺失并抑制ASIC通道(酸敏感离子通道)、更具体地同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道、异聚体ASICla+2a通道和异聚体ASICla+lb通道的新型肽。它们具体地是肽ASICalgin-1 (J1-Dpi)和 ASICalgin-2 (Ji _Dp2)，在小鼠体内中枢(鞘内和脑室内)注射后，这些肽对不同疼痛模式(化学、热、炎性)展现强有力的镇痛作用，该镇痛作用与吗啡相当但极大地与阿片受体活化无关。此外，这些肽当被中枢注射时不展现神经中毒作用。当通过皮下外周注射施用时，这些肽还施加镇痛作用，逆转炎性痛觉增敏。这两种肽是首次从黑树眼镜蛇(黑曼巴蛇)的毒液提取的展现镇痛作用的肽。不受这一解释限制，这些肽的最可能的作用机制表现为来自于ASIC离子通道的抑制，ASIC离子通道在疼痛信息的感知、传递和调节方面起重要作用。事实上，这些肽有效地抑制大鼠和人类的同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道和/或包含ASICla和/或ASIClb亚基的异聚体通道 。这两种肽具体地是同聚体ASIClb和ASICla通道和异聚体ASICla+ASIClb和ASICla+ASIC2a通道的首次已知的抑制剂。ASICalgin-1 (-Dpi)和ASICalgin-2 ( π _Dp2)肽还抑制感觉神经元和中枢神经元中存在的天然ASIC电流。它们对由辣椒素和由热活化的TRPVl电流无影响，且其本身也参与疼痛感知。它们不改变处于基础状态的神经元的电性质，但减少响应于能够活化ASIC通道的细胞外酸化的神经元兴奋性。因此，ASICalgin-1(i1-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2)肽在啮齿类中具有与吗啡相当的强有力的镇痛性质，这种镇痛性质当阿片受体被阻断时继续被观察到，且可以由其特异性抑制某些啮齿类和人类ASIC通道的能力来解释。所述肽的中枢注射没有引起毒性(神经毒性、抽搐等)，也没有对运动活动的任何影响(加速转棒试验，acceleratingrotarod test)。因此，ASICalgin-1(-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π _Dp2)肽能够被设想为是具有针对人类疼痛(例如，癌症相关疼痛、神经病性疼痛、手术后疼痛等)的治疗潜力的新型分子。因此，本发明的一个主题是一种肽，所述肽包括:(i)氨基酸序列LKCX4QHGKVVTCHRDMKFCYHNTGMPFRNLKLILQGCSSSCSETENNKCCSTDRCNK(SEQ ID No:I)其中X4代表任何氨基酸；或(ii)展现与序列SEQ ID No:1至少56%、优选地至少70%、优选地至少80%、最优选地至少98%的同一性，并保留包括序列SEQ ID No:1的所述肽的如上所述生物特性即，引起痛觉缺失并抑制包含选自ASICla和ASIClb亚基组成的组的至少一种亚基的至少一种ASIC通道的天然或合成序列。更具体地，根据本发明的所述肽作为包含选自ASICla和ASIClb亚基组成的组的至少一种亚基的同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道和/或异聚体ASIC通道、尤其是异聚体ASICla+ASIClb通道和/或异聚体ASICla+ASIC2a通道的阻断剂起作用。为了本发明的目的，术语“阻断剂”意为表示能够以浓度依赖性方式抑制由上述通道产生的电流的肽。例如，阻断剂是一种肽，其如PcTxl [Escoubas等，2000,上述][25]，能够在InM的浓度抑制由同聚体ASICla通道产生的电流的50%，或其如APETx2 [Diochot等，2004，上述][26]，能够在2 μ M的浓度抑制由大鼠异聚体ASICla+ASIC3通道产生的电流的50%。优选地，根据本发明的所述肽是从蛇黑树眼镜蛇的毒液提取的。例如，它们是借助反相极性高效液相色谱(RP-HPLC)通过连续分级分离而从毒液分离的。所述肽还可通过DNA重组方法或通过化学合成制备。优选地，根据本发明的所述肽包括具有序列SEQ ID No:1的ASICalgin-1 (i1-Dpi)或 ASICalgin-2 ( π-Dp2)肽，其中 X4 分别代表 Y 或 F (分别是 SEQ IDNo:2 和 3)。`本发明的一个主题还是一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码根据本发明的肽的核苷酸序列。优选地，根据本发明的所述多核苷酸包括核苷酸序列:atgaaaactctgctgctgaccttgctggtggtgacaatcgtgtgcctagacttaggatactccctgaaa
73 75
tgt txx caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgcc ttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:4)；或ctgaaatgt10txx12caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacact ggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaa taagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:22)；其中73txx75 和 10txx12 代表 tac、tat、ttt 或 ttc。优选地，根据本发明的所述多核苷酸包括的核苷酸序列使得该多核苷酸在严格条件下能够与核苷酸序列SEQ ID No:4或SEQ ID No:22、或其互补序列杂交。例如，所述多核苷酸是包括展现与序列SEQ ID No:4或序列SEQ ID No:22至少76%、优选地至少80%、最优选地至少98%的同一性的天然或合成序列的多核苷酸。本发明的一个主题还是包含根据本发明的多核苷酸的一种载体。优选地，根据本发明的所述载体是表达载体。
本发明的一个主题还是一种宿主细胞，所述宿主细胞包括一种或多种根据本发明的肽、根据本发明的多核苷酸或根据本发明的载体。本发明的一个主题还是一种药物组合物，所述药物组合物包括一种或多种根据本发明的肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞。根据本发明的药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的媒介物(碳酸钙、淀粉、滑石、乳糖、硬脂酸镁、阿拉伯胶等)，并可为溶液、悬液、糊剂、凝胶胶囊(gel capsule)、片剂、胶囊、粉末、颗粒、真空冻干粉、控释系统、微粒、微球(microsphere)或纳米微球Oianospherehj^质体等的形式。根据本发明的药物组合物还可口服、肌内、静脉内、皮下、局部、经肺途径、鼻内、含服、经直肠、舌下、皮内、腹膜内、鞘内等施用。根据本发明的药物组合物中活性成分(根据本发明的肽、多核苷酸、载体或宿主细胞)的有效量可以变化，从而获得有效剂量并且向哺乳动物施用镇痛的量。向特定哺乳动物施用的剂量取决于多种因素:施用途径、治疗持续时间、哺乳动物的大小和生理状态、活性成分的效力和哺乳动物对所述活性成分的响应。例如，鞘内施用的活性成分的有效镇痛量通常范围在大约5ng/kg哺乳动物体重至500 μ g/kg哺乳动物体重,优选地大约50ng/kg哺乳动物体重至50 μ g/kg哺乳动物体重,最优选地大约500ng/kg哺乳动物体重至5 μ g/kg哺乳动物体重。当使用其他施用途径时，活性成分的有效量可改变。有效镇痛量可通过在以下提及的一种或多种疼痛试验中以可根据以上提及的一种或多种标准改变的剂量试验活性成分来估计，以确定将施用于哺乳动物的活性成分的有效量。本发明的一个主题还是一种物质，所述物质选自:根据本发明的肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物,该物质用作药物。优选地，所述药物是镇痛剂，例如预期用于预防或治疗牵涉ASIC通道、尤其是包含选自ASICla和ASIClb亚基组成的组的至少一种亚基的ASIC通道、最具体地同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道、异聚体ASICla+ASIClb通道和/或异聚体ASICla+ASIC2a通道的活化的疼痛。例如，疼痛可(i)来源于中枢或外周ASIC通道的活化或(ii)引起其活化。例如，疼痛是选自包括炎 症性疼痛、神经病性疼痛、癌症相关疼痛、手术后疼痛、肌肉骨骼痛、内脏痛等的疼痛的组的疼痛，尤其是与ASIC通道活化相关的疼痛。优选地，所述药物预期用于预防或治疗牵涉ASIC通道、尤其是包含选自ASICla和ASIClb亚基组成的组的至少一种亚基的ASIC通道、最具体地同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道、异聚体ASICla+ASIClb通道和/或异聚体ASICla+ASIC2a通道的活化的病理状况。例如，其包括选自包括炎症、癌症、纤维肌痛、过敏性肠综合征等的组的病理状况。优选地，所述药物预期用于预防或治疗中枢神经疾病，例如选自包括以下的组的中枢神经疾病:创伤后应激、抑郁、焦虑、中风、癫痫、中枢炎症、多发性硬化、神经退行性疾病等。优选地,所述药物肠胃外施用，即局部区域性地(1coregionally)或中枢地(腹膜内、硬膜外、鞘内、脑室内、皮内等)和全身地(肌内、静脉内、皮下等)、口服地、局部地(经皮地等)或经由呼吸途径(吸入、滴注等)。最优选地，所述药物被鞘内、硬膜外、脑室内、腹膜内或皮下施用。本发明的一个主题还是一种物质，所述物质选自:根据本发明的肽、根据本发明的多核苷酸、根据本发明的载体、根据本发明的宿主细胞或根据本发明的药物组合物，该物质用作诊断工具。本发明的一个主题还是一种鉴定模拟根据本发明的肽的镇痛活性的化合物的方法，所述方法包括以下步骤:a)确定根据本发明的肽的镇痛活性；b)确定候选化合物的镇痛活性；c)比较步骤a)和步骤b)获得的镇痛活性；d)选择具有与根据本发明的肽的镇痛活性相当或比根据本发明的肽的镇痛活性更大的镇痛活性的候选化合物。本发明的一个主题还是一种鉴定模拟根据本发明的肽的镇痛活性的化合物的方法，所述方法包括以下步骤:a)将根据本发明的肽与样品接触，并测量所述肽与所述样品的结合；b)加入候选化合物，并评价所述化合物对所述肽与所述样品的结合的影响；

c)选择能够调节所述肽与所述样品的结合的候选化合物。为了本发明的目的，表述“模拟根据本发明的肽的镇痛活性的化合物”意为表示能够引起痛觉缺失并能够结合根据本发明的肽结合的ASIC通道或者能够以与根据本发明的肽相同或相似的生理方式作用，即可逆地和以浓度依赖性方式调节(抑制或刺激)由包含选自ASICla和ASIClb亚基组成的组的至少一种亚基的至少一种通道产生的、尤其是由同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道、异聚体ASICla+ASIClb通道和/或异聚体ASICla+ASIC2a通道产生的电流的候选化合物。例如，模拟根据本发明的肽的镇痛活性的化合物包括一种肽，其如PcTxl [Escoubas等，2000,上述][25]，能够在InM的浓度抑制由同聚体ASICla通道产生的电流的50%，或其如APETx2 [Diochot等，2004，上述][26]，能够在2μΜ的浓度抑制由大鼠异聚体ASICla+ASIC3通道产生的电流的50%。为了本发明的目的，术语“样品”意为表示预先从昆虫或哺乳动物的完整生物体或从永生化细胞系分离的细胞或组织。术语“镇痛活性”是指根据本发明的肽治疗哺乳动物中的疼痛、或减少疼痛的能力，如由试验疼痛或评价痛觉缺失的一种或多种常规实验模型，诸如以下所述的那些实验模型证实的。如此，可以确定根据本发明的肽的镇痛活性，例如，借助于一种或多种以下体内试验:i)缩尾/爪潜伏期(热伤害性刺激的测量)[Abott等，1982 ；Cridland和Henry，1992] [29，30]，ii)热/冷盘阈值(热伤害性刺激的测量)[Woolfe和Macdonald，1944，Ankier, 1974] [31,32], iii) von Frey 纤维丝阈值或 Randall-Selitto 试验或机械钳试验(instrumented pincher test)(机械伤害性刺激活性测量)[Kim 等，1993] [33], iv)动态重量分配试验(与姿势相关的伤害性刺激活性的测量)，V)自发伤害性刺激行为的测量，和/或一种或多种体外试验:例如，通过竞争筛选候选化合物，其中将已经标记的(例如，以放射性标记诸如C14、H3或I125、酶诸如过氧化物酶或碱性或酸性磷酸酶、荧光标记诸如FITC或罗丹明、抗体、抗原、生物素、顺磁离子、胶乳颗粒等)根据本发明的肽在允许其结合样品的条件下与所述样品接触，并测量与样品结合的所述标记的肽的结合，其中模拟所述标记的肽的活性的化合物与所述肽竞争结合受体(包含选自ASICla和ASIClb亚基组成的组的至少一种亚基的ASIC通道)上的位点。如此，当试验化合物通过结合受体来模拟所述肽的活性时，比当试验化合物不模拟所述肽的活性和不结合受体或以较小亲和性结合时，测量到更低量的可检测标记。作为替代方案，竞争筛选可以标记候选化合物代替标记根据本发明的肽来进行。如此，当试验化合物通过结合受体来模拟所述肽的活性时，比当试验化合物不模拟所述肽的活性和不结合受体或以较小亲和性结合时，测量到更高量的可检测标记。用于鉴定模拟肽的镇痛活性的化合物的方法的实例描述在(不被限于这一描述)，例如美国专利5877 026[34]中。其他益处在本领域技术人员阅读以下实施例后可变得更清楚，以下实施例由附图阐释，通过示例的方式提供。附图简述-

图1表示⑷从蛇黑树眼镜蛇的毒液分离的ASICalgin-1(J1-Dpi)和ASICalgin-2(31-Dp2)肽的氨基酸序列(分别是 SEQ ID No:2 和 3)，(B)编码 ASICalgin-1的互补DNA(cDNA)的核苷酸序列(SEQ ID No:5)。标出了信号序列(斜体)和最终肽(黑体)(参见SEQ ID No:6)、以及终止密码子O。未展示5’非编码末端的序列(对应SEQID No:9)。-图2 表示 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 (-Dp2)肽在小鼠中鞘内注射后的体内镇痛作用。化学性疼痛(甲醛):(A)以5分钟的间隔测量的自发性疼痛行为的动力学，(B)第I阶段(0-10分钟)急性疼痛和第II阶段(10-45分钟)炎性疼痛的总持续时间。急性热痛:(C)缩尾潜伏期的动力学，(D)对每只动物测量的曲线下面积(AUC)的平均值。炎性痛觉增敏:(E)缩爪潜伏期的动力学。相对于对照值的痛觉增敏的显著度..#，P< 0.05 ；##,p < 0.01< 0.001 ;由 ANOVA 检验，随后 Newman Keuls 多重比较进行。(F)在痛觉增敏水平(T-7min)，对每只动物测量`的曲线下面积(AUC)的平均值。示出了平均值土sem(平均值的标准差)，且试验的动物的数目(η)在图例中指出。相对于注射媒介物土纳洛酮(naxolone) (NAL)或者按照图中线指出的其他的显著性:不显著ns,p > 0.05
P < 0.05 ；**, P < 0.01 ；***, P < 0.001 ;由 ANOVA 检验，随后 Newman Keuls 多重比较进行。-图3表示ASICalgin-1(i1-Dpi)肽在小鼠中脑室内沣射后在急件热痛试验中的体内镇痛作用:(A)缩尾潜伏期的动力学，(B)对每只动物测量的曲线下面积(AUC)的平均值。示出了平均值土sem(平均值的标准差)。试验的动物的数目(η)在图例中指出。相对于注射媒介物或者按照图中线指出的其他的显著性:不显著ns，P > 0.05 ；*, P < 0.05广，P < 0.01 ；***, P < 0.001 ;由 ANOVA 检验，随后 Newman Keuls 多重比较进行。-图4表示ASICalgin-1(J1-Dpi)肽在皮下沣射后在炎件痛觉增敏试验中的体内镇痛作用=(A)缩爪潜伏期的动力学。将ASICalgin-1肽与角叉菜聚糖(口)同时皮下注射到左后爪，两个小时后再次注射(时间O或T0，□)。进行类似的程序，但在TO即在炎性痛觉增敏(■)出现后仅注射ASICalgin-1肽。(B)根据T_7min时的数值对每只动物计算的曲线下面积(AUC)的平均值。示出了平均值土sem。试验的动物的数目(η)在图例中指出。相对于注射媒介物的显著性Λ P < 0.05 ；**, P < 0.01 ；***, P < 0.001 ;由ANOVA检验，随后Newman Keuls多重比较进行。相对于注射角叉菜聚糖之前的对照值的显著性:#，P < 0.05 ；##, P < 0.01 ；###, P < 0.001 ；由成对 T 检验进行。-图5 表示 ASICalgin-1 ( π -Dpi)和 ASICalgin-2 ( π _Dp2)肽对由在 COS 细胞中异源表达的ASIC通道产生的电流的抑制。ASICalgin-1 (J1-Dpi)抑制的剂量响应曲线:大鼠同聚体ASICla电流，IC50 = 49nM(A)，人类同聚体ASICla电流，IC50 = 127nM(B)，大鼠同聚体 ASIClb 电流，IC5tl = 650nM (C)，大鼠异聚体 ASICla+ASIClb (比例 I: I)电流，IC50 =223nM(D)，和大鼠异聚体 ASICla+ASICa (比例 2: I)电流，IC5tl = 308nM(E)。示出了平均值土sem，η来自 4至 15 次实验。ASICalgin-1 ( π -Dpi, 674ηΜ)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2，852ηΜ)抑制电流的原始图在小图中显示。(F)电流的原始图，显示ASICalgin-1 (J1-Dpi，674nM)对人类异聚体ASICla+ASIC2a(比例2: I)电流的抑制。静息电位:_60mV，白色条:pH从7.4下降至5.5,黑色条:施加肽。-图6 表示 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2)肽对培养的鼠的感觉神经元和中枢神经元的天然ASIC电流的抑制。(A)ASICalgin-2(J1-Dp2，852nM，□)和ASICalgin-1 ( π _Dpl，674nM，■)对大鼠(η = 34)的感觉神经元的ASIC电流的平均抑制。在右边，在_50mV的静息电位记录且以pH从7.4下降至6来活化(白色条)的最初电流的实例。在感觉神经元中，总的ASIC电流来自于同聚体ASICla电流、ASIClb型电流和ASIC3型电流的混合物。(B)ASICalgin-2( ii _Dp2，852nM，□)和 ASICalgin-1 ( π _Dpl，674nM，■)对小鼠(η = 18)的背索神经元的ASIC电流的平均抑制。在右边，在_50mV的静息电位记录且以pH从7.4下降至6来活化(白色条)的最初电流的实例。(C)ASICalgin-2( Ji _Dp2，293nM，852nM 和 2.9 μ Μ, □)和 ASICalgin-1 ( π -Dpi, 224ηΜ 和 2.2 μ Μ, ■)对小鼠(η =26)的海马神经元的ASIC电流的平均抑制。在右边，在_50mV的静息电位记录且以pH从
7.4下降至5.5来活化(白色条)的最初电流的实例。在中枢神经元(小鼠的背索和海马)中，总的ASIC电流来自于同聚体ASICla电流和异聚体ASICla+ASIC2a电流的混合物。示出了平均值土 sem。-图7 表示 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 (-Dp2)肽对小鼠背部脊髓神经元的膜电位的影响。(A)神经元的膜电位,其中自发动作电位反映突触活动(虚线:OmV)。pH从7.4下降至6对ASIC电流的活化引起去极化,其峰值触发动作电位(放大)。ASICalgin-1肽(J1-Dpi，6 74nM)的施加不改变神经元的静息电位和自发活性。另一方面，由酸性PH下降引起的去极化减少，且不再引起动作电位。⑶由电刺激引发的动作电位(上方展示的矩形波电流)。四种响应是叠加的(左图):两种阈下的去极化和两种触发动作电位的其他去极化(虚线:0mV)。ASICalgin-2(J1-Dp2，852nM，右图)的施加不改变神经元的兴奋性。
实施例 实施例1:从蛇黑树眼镜蛇的毒液分离两种肽ASICALGIN-1 (J1-Dpi)和ASICALGIN-2(π_Dp2)毒液和肽毒素的纯化冻干的毒液来自Latoxan公司(Valence, France)。在乙酸(1% )中稀释毒液并通过将其通过含Sijphadex G50树脂的柱来分级分离。回收肽级分，随后在高效液相色谱(HPLC)系统上分级分离:1)将肽级分上样到阳离子交换柱上并且以pH梯度、以溶剂1%乙酸，pH3.0、和IM乙酸铵，pH6.8从其洗脱。包含ASICalgin的级分从60%乙酸铵开始被洗脱。2)将这一肽级分上样到C18反相柱上，并且以在溶剂水-0.1%TFA和乙腈-0.1%TFA之间的疏水性梯度洗脱其组成部分。分别在26%和27%乙腈洗脱纯的ASICalgin-1和ASICalgin-2 肽。肽表征 氨基酸分析ASICalgin-1和ASICalgin-2是两种基本的异肽(isopeptide),具有包含形成4个二硫键桥的8个半胱氨酸的57个氨基酸的序列(图1A，分别是SEQ ID No:2和3)，其之前是21个氨基酸的信号序列(图1B，参见SEQ ID No:6)。它们仅由于SEQ ID No:1、2或3的位置4 (SEQ ID No:6的位置25)的氨基酸而彼此不同。通过克隆确定氨基酸序列ASICalgin-1的完整序列(图1B)通过从粗制毒液中以痕量存在的信使RNA(mRNA)由PCR克隆cDNA来确定。将25mg蛇黑树眼镜蛇的毒液(Sigma)重悬在裂解缓冲液中:IOOmM tris-HCl 缓冲液，ρΗ7.5 中的 500mMLiCl、IOmM EDTAU % (w/v)LiDS 和 5mM 二硫苏糖醇。借助嫁接有dT25寡核苷酸的磁珠(Dynal，UK)来捕捉信使RNA。这些寡核苷酸直接用作以PrimeScript 逆转录酶(TaKaRa Bio Inc., Japan)进行mRNA向cDNA的逆转录的引物。所得的固相cDNA文库用于以通过直接N末端测序从毒素的部分蛋白序列确定的有义(TGITTYCARCAYGGIAARGT, SEQ ID No:7)和反义(YTTIARRT TICGRAAIGGCAT，SEQ ID No:8)寡核苷酸进行简并PCR。为了排除由于聚合酶的任何差错，进行三次独立PCR，这产生期望大小(89个碱基对)的片段,随后将其亚克隆到pGEMTeasy载体(Promega)中并测序。借助这些序列，合成了具有添加的EcoRI限制性位点的特异性有义寡核苷酸(ACAC(GAATTC)GCTATCATAACACTGGCATG，SEQ ID NO:9)、以及非特异性多聚_dT30反义寡核苷酸，其也带有添加的EcoRI位点ACAC (GAATTC) dT30，SEQ ID No:10)。这两种寡核苷酸使得有可能为了鉴定的目的由PCR扩增完整的3’ -编码和3’ -非编码末端。三次独立PCR产生大约400个碱基对的条带，且将其亚克隆进入pGEMTeasy载体的EcoRI限制性位点使得有可能对其测序同时排除由聚合酶产生的任何差错。基于该3’ -和5’ -非编码序列，合成了构架编码序列的有义寡核苷酸(ACAC (GAATTC) TCCAGAGAAGATCGCAAGATG, SEQ ID No:11)和反义寡核苷酸(ACAC (GAATTC)ATTTAGCCACTCGTAGAGCTA, SEQ ID No:12)。对固相cDNA文库进行四次独立PCR，并且再次将PCR产物亚克隆到pGEMTeasy载体中，以获得ASICalgin-1毒素前体的完整核苷酸序列。狀测丨序通过在自动测序仪(LC491, Applied Biosystems, USA)上对还原的和烧基化的肽直接N末端测序，证实序列到氨基酸Asp40。酶促裂解为了证实序列，对肽进行以下酶处理:(a) V8蛋白酶，并在C18反相HPLC柱上分离消化的肽。在位置D15和E43的裂解、和在HPLC上对被完全再次测序的分子量1786.9Da(肽1-15)和部分测序的3194.0Ta (肽16-43)的两种肽的分离，使得有可能证实N末端序列。(b)胰蛋白酶消化，由质谱直接分析。胰蛋白酶片段还证实ASICalgin的肽序列的N末端序列以及其他部分。由MS/MS分析检测并测序的胰蛋白酶肽在以下表I中提供。表I
权利要求
1.一种肽，所述肽包括氨基酸序列LKCX4QHGKVVTCHRDMKFCYHNTGMPFRNLKLILQGCSSSCSETENN KCCSTDRCNK(SEQ ID No:1)其中X4代表任何氨基酸；或展现与序列SEQ ID No:1至少56%的同一性并保留包括序列SEQ ID No:1的所述肽的生物特性的序列。
2.按权利要求1所述的肽，其中所述肽是包含选自由ASICla亚基和ASIClb亚基组成的组的至少一种亚基的至少一种ASIC通道的阻断剂。
3.按权利要求2所述的肽，其中所述肽是同聚体ASICla通道、同聚体ASIClb通道、异聚体ASICla+ASIClb通道和/或异聚体ASICla+ASIC2a通道的阻断剂。
4.按权利要求1至3任一项所述的肽，其中在序列SEQID No:1中，X4代表Y或F。
5.一种多核苷酸，包括编码如权利要求1至4任一项所定义的肽的核苷酸序列。
6.按权利要求5所述的多核苷酸,包括核苷酸序列: atgaaaactctgctgctgaccttgctggtggtgacaatcgtgtgcctagacttaggatactccctgaaatg t73txx75caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgcc ttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:4);或ctgaaatgt10txx12caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacact ggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaa taagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:22)；其中 73txx75 和 1Qtxx12 代表 tac、tat、ttt 或 ttc。
7.按权利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在严格条件下与核苷酸序列SEQID No:4或SEQ ID No:22、或其互补序列杂交。
8.按权利要求5或7所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括展现与序列SEQID No:4或序列SEQ ID No:22至少76%的同一性的天然或合成序列。
9.一种载体，包含如权利要求5至8任一项所定义的多核苷酸。
10.按权利要求9所述的载体，其中所述载体是表达载体。
11.一种宿主细胞，包括一种或多种如权利要求1至4任一项所定义的肽、如权利要求5至8任一项所定义的多核苷酸、或如权利要求9和10任一项所定义的载体。
12.一种药物组合物，包括一种或多种如权利要求1至4任一项所定义的肽、如权利要求5至8任一项所定义的多核苷酸、如权利要求9和10任一项所定义的载体、或如权利要求11所定义的宿主细胞。
13.一种物质,选自: -如权利要求1至4任一项所定义的肽； -如权利要求5至8任一项所定义的多核苷酸； -如权利要求9和10任一项所定义的载体；或 -如权利要求11所定义的宿主细胞； -如权利要求12所定义的药物组合物； 所述物质用作药物。
14.按权利要求13所述的物质，其中所述药物是镇痛剂。
15.按权利要求14所述的物质，其中所述镇痛剂预期用于预防或治疗牵涉ASIC通道的活化的疼痛或病理状况。
16.按权利要求15所述的物质，其中所述牵涉ASIC通道的活化的疼痛和病理状况选自包括以下的组:炎症性疼痛、神经病性疼痛、癌症相关疼痛、手术后疼痛、肌肉骨骼痛和内脏痛、炎症、癌症、纤维肌痛和过敏性肠综合征。
17.按权利要求13所述的物质，其中所述药物预期用于预防或治疗选自包括以下的组的中枢神经病:抑郁、焦虑、中风、癫痫、中枢炎症和神经退行性疾病。
18.按权利要求13至17任一项所述的物质，其中所述药物被中枢地、皮下地、经皮地、全身地、口服地或经由呼吸途径施用。
19.一种物质,选自: -如权利要求1至4任一项所定义的肽； -如权利要求5至8任一项所定义的多核苷酸； -如权利要求9和10任一项所定义的载体；或 -如权利要求11所定义的宿主细胞； -如权利要求12所定义的药物组合物； 所述物质用作诊断工具。
20.一种鉴定模拟如权利要求1至4任一项所定义的肽的镇痛活性的化合物的方法，包括以下步骤: a.确定如权利要求1至4任一项所定义的肽的镇痛活性； b.确定候选化合物的镇痛活性； c.比较步骤a.和步骤b.获得的镇痛活性； d.选择具有与所述肽的镇痛活性相当或比所述肽的镇痛活性更大的镇痛活性的候选化合物。
21.一种鉴定模拟如权利要求1至4任一项所定义的肽的镇痛活性的化合物的方法，包括以下步骤: a)将如权利要求1至4任一项所定义的肽与样品接触，并测量所述肽与所述样品的结合； b)加入候选化合物， 并评价所述化合物对所述肽与所述样品的结合的影响； c)选择能够调节所述肽与所述样品的结合的候选化合物。
全文摘要
本发明涉及引起痛觉缺失并抑制ASIC通道(酸敏感离子通道)的新型分离的肽，涉及编码所述肽的多核苷酸，还涉及包含其的药物组合物、宿主细胞和载体。具体地，所述肽从蛇黑树眼镜蛇(Dendroaspis polylepis)的毒液分离。本发明还涉及其用作诊断工具或用作药物、具体地用作镇痛剂、或用于鉴定镇痛剂分子或抑制ASIC通道的分子的用途。
文档编号C07K14/46GK103097404SQ201180043328
公开日2013年5月8日 申请日期2011年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者埃里克·林古艾格利亚, 西尔维·狄奥舒特, 安妮·巴伦-福斯特, 米格尔·萨利纳斯, 米歇尔·拉兹敦斯基 申请人:国家科学研究中心