具有ace抑制活性的源于油菜花粉的多肽化合物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽油菜花粉的具有ACE抑制活性的多肽化合物，其特征在于：所述 多肽为IIIALLLYK制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的应用。
【背景技术】
[0002] 高血压药物研究的一个祀点是抑制血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE)，ACE是存在于血管内皮细胞、上皮吸收细胞、神经上皮细胞、雄性生殖细胞中 的一种含锌的二肽羧酶。在人体肾素一血管紧张素系统（RAS)和激肽酶释放酶一激肽系 统（KKS)中，血管紧张素转换酶（ACE)对机体血压和心血管功能起着重要的调节作用（如图 1)。在RAS中，ACE是起限速作用，ACE可将不具活性的十肽血管紧张素I转化为具有强烈收 缩血管作用的八肽血管紧张素II，同时血管紧张素II还能刺激醛固酮的分泌进而促进肾 脏对水、钠、钾的重吸收，引起钠贮量和血容量的增加，使血压升高。在KKS中，ACE还能催化 与心血管系统具有相互作用的神经肽、脑啡肽和P物质等的降解。血管紧张素转换酶(ACE) 抑制剂是目前常规应用的六大类降压药物之一，ACE抑制剂不仅仅用于治疗高血压，同时已 证实可以防止心力衰竭，减少心肌梗死、脑卒中、糖尿病和肾损害发生的危险。ACE抑制剂 对心血管疾病的防治具有两个明显的特征：确切的降压疗效和独特的心脏及血管保护。ACE 抑制剂可能通过阻止心房的电重构和解剖重构，预防了心房纤颤(房颤，AF)的发生。多肽是 一类重要的ACE抑制剂，天然蛋白质的酶解肽是ACE抑制剂肽的主要来源(文献2 :LieSel〇t Vercruysse1JohnVanCamp,GuySmagghe,J.Agric.FoodChem2005, 53:8106-8115)。血管 紧张素转化酶对于机体血压和心血管功能起着重要的调节作用，因此抑制ACE活性的药物 在心血管、心力衰竭等疾病的治疗中发挥重要作用。多肽类的ACE抑制剂在降血压的同时 不会引起常见降压药物的干咳等副作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供多肽IIIALLLYK在抑制ACE活性中的应用；多肽IIIALLLYK 具有ACE抑制活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好 的应用前景。
[0004] 为实现上述目的，本发明以所述多肽IIIALLLYK为抑制ACE活性的有效成份。其 具有序列表SEQIDNO:1中氨基酸序列；多肽IIIALLLYK为ACE抑制剂的活性成份，其中可 添加药物学上可接受的载体或辅料。
[0005] 具有抑制ACE活性的多肽化合物IIIALLLYK的氨基酸序列为IIe-IIe-IIe-Ala-L eu-Leu-Leu-Tyr-Lys。单链线性结构，分子量为1059. 4Da，白色粉末状，易溶于水，对ACE活 性具有很强的抑制作用，IC5tl为28. 2iiM。
[0006] 多肽IIIALLLYK具备ACE抑制剂所要求的特征：
[0007]I.ACE倾向于C末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制剂，C末端为 Try，Phe，Tyr和Pro而N端为支链氨基酸的肽段具有较强的ACE抑制活性。多肽IIIALLLYK 的C末端三肽均为疏水性氨基酸分别为Leu、Tyr和Lys，N末端IIe是带支链的氨基酸，因 此IIIALLLYK满足ACE抑制剂的所需的肽结构要求。
[0008] 2.肽的疏水性是影响其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有较多的疏水 氨基酸。多肽IIIALLLYK的疏水氨基酸有Ala，Val，Leu，Tyr，Lys，lie，含有较多的疏水氨 基酸。
[0009] 经ACE抑制活性检测，多肽IIIALLLYK的IC50为28. 2iiM。
[0010] 本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0011] 本发明首次从油菜花粉中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑 制ACE的活性，因此作为治疗高血压、心脏病等心血管疾病药物和保健品的先导化合物具 有良好的潜力和应用前景。
【附图说明】
[0012] 图IACE对血压的调节作用框图。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1多肽IIIALLLYK的制备
[0014] 20g油菜蜂花粉加入液氮研磨破壁后，加入pH=7. 4、50mMTris-HCl缓冲液150ml, 超声提取三次(一次：400W，超声4s，停4s，80个循环）；提取结束后于4°C、25000g离心lh， 取上清液，加入上清液4倍体积的混合溶剂(丙酮：乙醇：乙酸=50:50:0. 1 (体积比））沉淀 过夜；沉淀结束后将所有样品于4°C、25000g离心30分钟，弃去上清，取沉淀用丙酮洗涤脱 色，然后于4°C、25000g离心15分钟，弃去上清，沉淀继续用丙酮反复洗涤直至上清无色，最 后用体积浓度75%乙醇洗涤沉淀并于4°C、25000g离心10分钟，弃上清，取沉淀物冷冻干 燥，得冻干蛋白。冻干蛋白用含有8M尿素的pH=7.4、100mMNH4HC03缓冲液复溶，以酶：蛋 白=1:25 (w/w)比例加入胰蛋白酶，37°C酶解20小时。上述酶解产物经制备色谱分离，色 谱柱为C18 (20X250mm，10iim)，所用的流动相A为质量浓度0. 1%甲酸/水溶液，流动相 B为质量浓度0. 1%的甲酸/乙腈溶液，流速为2mL/min，洗脱过程如下：5%B- 35%B(V/V) - 80%B(V/V)。将在280nm下所检测的色谱峰分别收集得到的不同组分冷冻干燥，为乳白色粉 末状样品。
[0015] 所得样品经反相液相色谱-串联质谱系统（RPLC-MS/MS)分析：将冷冻干燥后的酶 解样品用体积浓度〇. 1%甲酸溶液配制为〇. 4yg/yL，进样20yL进行LTQ线性离子阱质谱 (配置纳升级电喷雾源)分析。利用Xcalibur软件（Thermo)进行系统控制和数据收集。实 验得到的质谱数据结果分别在honeybee,BrassicacampestrisL.蛋白质数据库（http:// www.uniprot.org/)中进行检索，技术重复3次，数据库检索软件为SEQUEST。获得序列为 Ile-Ile-IIe-Ala-Leu-Leu-Leu-Tyr-Lys的多月太。
[0016] 实施例2多肽IIIALLLYK的ACE抑制活性检测
[0017]ACE在37°C、PH8. 3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟底物Hippuryl-L-His tidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处有特征紫外吸收峰。当加入ACE抑 制物时，ACE对HHL的催化作用受到抑制，马尿酸的生成量会减少。通过测定加入抑制剂前 后的马尿酸紫外吸收值可以计算出抑制活性的大小。
[0018] 反应体系
[0019]缓冲液为 0? 05M，PH8. 3 硼酸盐缓冲液；底物为Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL)，MW429. 47,用上述缓冲液配成 5mM;ACE(angiotensin-convertingenzyme)用上述 缓冲液配成〇.lU/ml。
[0020] ODa(对照组，为不存在抑制剂但存在酶时的吸光值):50ill缓冲液+50ulHHL+50ill 缓冲液于37°C水浴5min，然后加入50iUACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl终止 反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0. 8ml上清， 90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为0Da。
[0021] ODb (多肽样品组，为存在抑制剂和酶时的吸光值）：50ill样品+50iilHHL+50ill 缓冲液于37°C水浴5min，然后加入50illACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl终 止反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为0Db。
[0022] 0DC(空白组，为不存在抑制剂和酶时的吸光值):50ill缓冲液+50iilHHL+50ill缓 冲液于37°C水浴5min，然后加入50ill缓冲液，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl终 止反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为0DC。
[0023]ACE抑制率（％)= (ODa-ODb)AODa-ODc)X100%
[0024]分别用0? 07275mg/ml, 0? 04850mg/ml, 0? 02425mg/ml, 0? 01217mg/ml的多肽浓度， 按上述方法进行ACE抑制活性检测。结果如下表：
[0025]
【主权项】
1. 具有ACE抑制活性的源于油菜花粉的多肽化合物，其特征在于：所述多肽为 IIIALLLYK，具有序列表SEQ ID NO :1中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为，IIe-IIe -Ile-Ala-Leu-Leu-Leu-Tyr-LySo
2. -种权利要求1所述多肽在制备ACE抑制剂或心血管药物中的应用。
3. 按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述ACE抑制剂是以多肽IIIALLLYK为 活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
【专利摘要】本发明涉及源于油菜花粉的具有抑制血管紧张素转换酶（angiotensin-converting？enzyme，ACE）活性的多肽化合物IIIALLLYK，其氨基酸序列分别为IIe-IIe-IIe-Ala-Leu-Leu-Leu-Tyr-Lys。多肽IIIALLLYK具有ACE抑制活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
【IPC分类】A61K38-08, A61P9-12, C07K7-06, A61P9-00
【公开号】CN104558113
【申请号】CN201310507799
【发明人】邹汉法, 靳艳, 郭静
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月21日