具有ace抑制活性的多肽及其在降血压药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽AELDIVLALF在制备抑制血管紧张素转换酶(ACE)及降血压中的 应用。
【背景技术】
[0002] 高血压是一种常见的心血管疾病，发病率高、是引发心、脑、肾和血管等各种并发 症和导致中风、促进动脉粥样硬化、冠心病的一个重要危险因子。我国高血压患者已超过 1.6亿人口，治疗和预防高血压是当前社会十分重要的课题。肽是一类重要的降血压药物， 肽降血压的作用祀点是抑制血管紧张素转化酶（angiotensin-convertingenzyme,ACE)的 活性（文献I:VanessaVermeirssen，JohnVanCamp，WillyVerstraete，BritishJournal ofNutrition2004,92 :357-366)。血管紧张素转化酶可将不具活性的十肽血管紧张素I 转化为具有强烈收缩血管作用的八肽血管紧张素II，从而使血压升高，因此抑制ACE活性 可有效控制高血压。多肽是一类重要的ACE抑制剂，天然蛋白质的酶解肽是ACE抑制剂肽 的主要来源（文献 2:LieselotVerc;ruysse，JohnVanCamp，GuySmagghe，J.Agric.Food Chem2005, 53:8106-8115)。血管紧张素转化酶对于机体血压和心血管功能起着重要的调节 作用，因此抑制ACE活性的药物在心血管、心力衰竭等疾病的治疗中发挥重要作用。多肽类 的ACE抑制剂在降血压的同时不会引起常见降压药物的干咳等副作用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供多肽AELDIVLALF在抑制ACE活性和降血压中的应用；多肽 AELDIVLALF具有ACE抑制活性及降血压活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和 药物先导化合物具有良好的应用前景。
[0004] 为实现上述目的，本发明以所述多肽AELDIVLALF为抑制ACE活性和降血压的有效 成份。
[0005] 其具有序列表SEQIDNO:1中氨基酸序列；多肽AELDIVLALF为ACE抑制剂及降血 压药物的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
[0006] 具有抑制ACE活性和降血压活性的多肽化合物AELDIVLALF的氨基酸序列为Ala-Glu-Leu-Asp-IIe-Val-Leu-Ala-Leu-Phe。单链线性结构，分子量为 1103. 3Da，白色粉末状， 易溶于水，对ACE活性具有很强的抑制作用，IC5tl为10. 6iiM。
[0007] 多肽AELDIVLALF具备ACE抑制剂所要求的特征：
[0008]I.ACE倾向于C末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制剂，C末端为 Try，Phe，Tyr和Pro而N端为支链氨基酸的肽段具有较强的ACE抑制活性。多肽AELDIVLALF 的C末端三肽均为疏水性氨基酸分别为Ala、Leu和Phe，C末端为Phe，因此满足ACE抑制 剂的绝大部分要求。
[0009] 2.肽的疏水性是影响其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有较多的疏水 氨基酸。多肽AELDIVLALF的疏水氨基酸有Ala，Val，Leu，Phe，lie，含有较多的疏水氨基 酸。
[0010] 经ACE抑制活性检测，多肽AELDIVLALF的IC5tl为10. 6i!M。
[0011] 本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0012] 本发明首次从油菜花粉中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑 制ACE的活性，因此作为治疗高血压、心脏病等心血管疾病药物和保健品的先导化合物具 有良好的潜力和应用前景。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1多肽AELDIVLALF的制备
[0014] 20g油菜蜂花粉加入液氮研磨破壁后，加入pH=7. 4、50mMTris-HCl缓冲液150ml, 超声提取三次(一次：400W，超声4s，停4s，80个循环）；提取结束后于4°C、25000g离心lh， 取上清液，加入上清液4倍体积的混合溶剂(丙酮：乙醇：乙酸=50:50:0. 1 (体积比））沉淀 过夜；沉淀结束后将所有样品于4°C、25000g离心30分钟，弃去上清，取沉淀用丙酮洗涤脱 色，然后于4°C、25000g离心15分钟，弃去上清，沉淀继续用丙酮反复洗涤直至上清无色，最 后用体积浓度75%乙醇洗涤沉淀并于4°C、25000g离心10分钟，弃上清，取沉淀物冷冻干 燥，得冻干蛋白。冻干蛋白用含有8M尿素的pH=7. 4、100mMNH4HC03缓冲液复溶，以酶：蛋 白=1:25 (w/w)比例加入胰蛋白酶，37°C酶解20小时。上述酶解产物经制备色谱分离，色 谱柱为C18 (20X250mm，10iim)，所用的流动相A为质量浓度0. 1%甲酸/水溶液，流动相 B为质量浓度0. 1%的甲酸/乙腈溶液，流速为2mL/min，洗脱过程如下：5%B- 35%B(V/V) - 80%B(V/V)。将在280nm下所检测到的色谱峰分别收集得到不同组分冷冻干燥，为乳白色粉 末状样品。
[0015] 所得样品经反相液相色谱-串联质谱系统（RPLC-MS/MS)分析：将冷冻干燥后的酶 解样品用体积浓度〇. 1%甲酸溶液配制为〇. 4yg/yL，进样20yL进行LTQ线性离子阱质谱 (配置纳升级电喷雾源)分析。利用Xcalibur软件（Thermo)进行系统控制和数据收集。实 验得到的质谱数据结果分别在honeybee,BrassicacampestrisL.蛋白质数据库（http:// www.uniprot.org/)中进行检索，技术重复3次，数据库检索软件为SEQUEST。获得序列为 Ala-Glu-Leu-Asp-IIe-Val-Leu-Ala-Leu-Phe〇
[0016] 实施例2多肽AELDIVLALF的ACE抑制活性检测
[0017]ACE在37°C、PH8. 3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟底物Hippuryl-L-His tidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处有特征紫外吸收峰。当加入ACE抑 制物时，ACE对HHL的催化作用受到抑制，马尿酸的生成量会减少。通过测定加入抑制剂前 后的马尿酸紫外吸收值可以计算出抑制活性的大小。
[0018] 反应体系
[0019]缓冲液为 0? 05M，PH8.3 硼酸盐缓冲液；底物为Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL)，MW429. 47,用上述缓冲液配成 5mM;ACE(angiotensin-convertingenzyme)用上述 缓冲液配成〇.lU/ml。
[0020]ODa(对照组，为不存在抑制剂但存在酶时的吸光值):50ill缓冲液+50ulHHL+50ill 缓冲液于37°C水浴5min，然后加入50illACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl终 止反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为0Da。
[0021] ODb (多肽样品组，为存在抑制剂和酶时的吸光值）：50ill样品+50iilHHL+50ill 缓冲液于37°C水浴5min，然后加入50iUACE，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl终止 反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0. 8ml上清， 90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为0Db。
[0022] 0DC(空白组，为不存在抑制剂和酶时的吸光值):50ill缓冲液+50iilHHL+50ill缓 冲液于37°C水浴5min，然后加入50ill缓冲液，37°C水浴30min，加入200ill、IM的HCl终 止反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0. 8ml上 清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为0DC。
[0023]ACE抑制率（％)= (ODa-ODb)AODa-ODc)X100%
[0024]分别用 0? 0495mg/ml, 0? 02475mg/ml, 0? 01485mg/ml, 0? 00495mg/ml的多肤浓度， 按上述方法进行ACE抑制活性检测。结果如下表：
[0025]
【主权项】
1. 具有ACE抑制活性的多肽，其特征在于：所述多肽为AELDIVLALF，具有序列表SEQ ID NO :1中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为，Ala-Glu-Leu-Asp-IIe-Val-Leu-Ala-Le u-Phe。
2. -种权利要求1所述多肽在制备ACE抑制剂或降血压药物中的应用。
3. 按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述ACE抑制剂及降血压药物是以多肽 AELDIVLALF为活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
【专利摘要】本发明涉及一种具有ACE抑制活性的多肽化合物AELDIVLALF，其氨基酸序列分别为Ala-Glu-Leu-Asp-IIe-Val-Leu-Ala-Leu-Phe。多肽AELDIVLALF具有ACE抑制活性及降血压活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
【IPC分类】A61K38-08, A61P9-12, C07K7-06
【公开号】CN104558110
【申请号】CN201310497269
【发明人】邹汉法, 靳艳, 郭静
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月21日