基于血红蛋白衍生肽的新型药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含至少一种Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质和至少一种血红蛋 白衍生肽以及任选的药学可接受的载体的药物组合物。本发明还涉及用于预防和/或治疗 肿瘤、预防和/或治疗感染、预防和/或治疗变态反应、预防和/或治疗年龄相关性免疫失 衡、刺激先天性和适应性免疫系统和/或减轻辐照的不良副作用的根据本发明的药物组合 物。此外，本发明还涉及血红蛋白衍生肽以及其在治疗细菌感染中的用途。
[0002] 在本说明书中，引用了许多文件包括专利申请和制造商的手册。这些文件的公开 内容虽然不视为与本发明的专利性有关，但整体通过引用并入本文。更具体而言，所有提及 的文件均通过引用并入本文，其程度与每个个别文本特别且个别指出通过引用并入相同。
【背景技术】
[0003] 在过去，胎儿器官、组织或细胞的转移已作为针对疾病例如癌症或严重感染以及 针对衰老过程的预防或治疗措施传播。胎儿组织的提取物因此看起来具有有利的医学效 应，并且有时在癌症和某些感染的治疗或预防中特别推荐。尽管本领域中相当大的兴趣，但 这些胎儿组织提取物中的医学有效原理通常是难以捉摸的。此类组合物的注册问题是不言 而喻的。
[0004] 另外，自一个多世纪以来，通过注射活的和/或热杀死的细菌的癌症治疗得到传 播（Coley，W.B. :Am.J· Med. Sci 105,487-511(1893))。约 50 年前，显示此类治疗的肿瘤坏 死效应是由于细菌内毒素。内毒素也称为脂多糖（LPS)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的组成 成分。内毒素活化先天性免疫系统且促成适应性免疫系统的活化。在严重革兰氏阴性感染 期间，内毒素在脓毒性休克的发展中起关键作用（Rietschel等人1994)。然而，低浓度的 LPS以及LPS部分结构例如单磷酰脂质A(MPLA)，显示出对于宿主有利的效应。这些效应包 括由于其惊人的免疫刺激和免疫调节活性，对感染的抗性增强和针对恶性肿瘤的保护（Fox 等人2010)。有害以及有利的宿主应答并非被LPS直接诱导，而是由免疫调节剂分子介导， 所述免疫调节剂分子例如肿瘤坏死因子（TNF)、白细胞介素家族成员（IL-1、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12)、干扰素、还原氧种类和脂质。这些介质主要由单核细胞/巨噬细胞释放， 而且还由其他细胞类型如血管细胞、上皮细胞、多形核细胞和肥大细胞释放（Galanos等人 (1992)，Loppnow(1994) ;Supajatura等人（2001))。先前，T细胞也已显示参与针对LPS的 应答（Mattern 等人（1994))。
[0005] 绵羊或人起源的胎儿血红蛋白（HbF)已发现在体外在来自鼠巨噬细胞和人外周 血单核细胞的细胞因子诱导中与LPS和脂质A协同作用。另外，在体内观察到LPS诱导的 通过HbF的先天性和适应性免疫应答的调节（Gorczynski等人（2006) ;Howe等人（2008a); TO 2004/073728A2)。这种协同活性可以显示主要位于胎儿HbF的γ链（Hby)中。关于 Hb γ和脂质A之间的合作效应的一种解释是Hb诱导的脂质A的构象变化，这导致增强的生 物活性。生物物理学分析显示Hb以及Hb链导致脂质A成为更圆锥形的内毒素构象，其中 Hb嵌入内毒素聚集体内，随后为崩解过程（Howe等人（2008a) !Brandenburg等人（2003); Howe等人（2007) ;Howe等人（2008b))。近来，已显示Hb的Hb α -亚基和Hb β -亚基具有 LPS结合位点。这些结合位点的特征在于得自Hb α -亚基和Hb β -亚基序列的独特合成肽， 其能够中和而不是协同LPS的内毒素活性（Bahl等人（2011))。
[0006] 尽管这些发展，但全长胎儿血红蛋白或其单链的使用具有下述缺点：所述全长蛋 白质必须借助于纯化或经由重组或（半）合成方式由组织提供，所有这些方式均为昂贵和 耗时的。
[0007] 相应地，仍存在提供可以更有利地用于抵抗疾病例如肿瘤或严重感染或者衰老中 的手段的需要，所述手段易于制备并且与上文讨论的缺点无关。
[0008] 这种需要通过提供在权利要求中表征的实施方案得到解决。
【发明内容】
[0009] 相应地，本发明涉及包含至少一种Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质和至少一种 血红蛋白衍生肽以及任选的药学可接受的载体的药物组合物，其中所述血红蛋白衍生肽由 下述组成：
[0010] (a)由式I的序列组成的氨基酸序列：
[0011] A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19(式 I)，
[0012] 其中
[0013] Al选自苏氨酸、半胱氨酸和丝氨酸；
[0014] A2选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
[0015] A3选自亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0016] A4选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0017] A5选自异亮氨酸、组氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0018] A6选自组氨酸、精氨酸和亮氨酸；
[0019] A7选自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
[0020] A8选自甘氨酸和丙氨酸；
[0021] A9选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
[0022] AlO选自谷氨酸和天冬氨酸；
[0023] All选自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
[0024] A12选自苏氨酸和丝氨酸；
[0025] A13选自脯氨酸和甘氨酸；
[0026] A14选自谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；
[0027] A15选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
[0028] A16选自谷氨酰胺和天冬酰胺；
[0029] A17选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0030] A18选自丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸；和
[0031] A19选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；
[0032] 和
[0033] (b)位于（a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列和/或位于（a)的氨基酸序列 的C末端的氨基酸序列，
[0034] 其中
[0035] (b-i)位于（a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列选自：
[0036] NI ：V ；
[0037] N2 ：LV ；
[0038] N3 ：VLV ；
[0039] N4 ：NVLV(SEQ ID NO: 108)；
[0040] N5 ：GNVLV(SEQ ID NO: 109)；
[0041] N6 ：LGNVLV (SEQ ID NO :4)；
[0042] N7 ：LLGNVLV(SEQ ID NO: HO)；
[0043] N8 ：KLLGNVLV(SEQ ID NO:111)；
[0044] N9 ：FKLLGNVLV(SEQ ID NO:112)；
[0045] NlO ：NFKLLGNVLV(SEQ ID NO:113)；
[0046] Nil ：ENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:114)；
[0047] N12 ：PENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:115)；
[0048] N13 ：DPENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:116)；
[0049] N14 ：VDPENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:117)；
[0050] N15 :HVDPENFKLLGNVLV(SEQ ID N0:118);和
[0051] N16 ：LHVDPENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:5)；
[0052] 并且其中
[0053] (b-ii)位于（a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列选自：
[0054] (1)由式II的序列组成的氨基酸序列：
[0055] C1-C2-C3-C4-C5(式 II)，
[0056] 其中
[0057] Cl :选自谷氨酰胺、天冬酰胺和酪氨酸；
[0058] C2 :选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
[0059] C3 :选自甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
[0060] C4 :选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；和
[0061] C5 :选自苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸和赖氨酸；
[0062] (2)由式III的序列组成的氨基酸序列：
[0063] C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12(式 III)，
[0064] 其中
[0065] Cl 至 C5 如（b-ii) (1)中定义；
[0066] C6 :选自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0067] C7 :选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸；
[0068] C8 :选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0069] C9 :选自丝氨酸、天冬酰胺和苏氨酸；
[0070] ClO :选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0071] Cll :选自亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和
[0072] C12 :是由氨基酸序列SSRYH组成的肽或不存在；和
[0073] (3)由式IV的序列组成的氨基酸序列：
[0074] C1-C2-C3-C4-C5-C6-X(式 IV)，
[0075] 其中
[0076] Cl 至 C5 如（b-ii) (1)中定义；
[0077] C6 :选自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；
[0078] X :是由以任何次序的五种氨基酸残基丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸组 成的肽，
[0079] 或其拟肽。
[0080] 依照本发明，术语"药物组合物"指用于施用于患者优选人患者的组合物。本发明 的药物组合物包含至少一种Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质和至少一种血红蛋白衍生 肽。本发明的药物组合物可以任选且另外包含药学可接受的载体。"药学可接受的载体"意 指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、赋形剂、封装材料或制剂助剂。合 适的药学载体的例子是本领域众所周知的，并且包括氯化钠溶液、磷酸盐缓冲氯化钠溶液、 水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、无菌溶液、有机溶剂等。优选地，载体是肠胃 外载体，更优选与接受者的血液等渗的溶液。如本文使用的，术语"肠胃外的"指施用模式， 其包括静脉内、肌内、腹膜内和皮下注射和输注。这些施用模式连同肌内、皮内、鼻内、经口、 经颊、舌下、粘膜（例如经由鼻喷雾剂、滴鼻剂或滴眼剂或霜剂以及直肠或阴道（凝胶）制 剂）或支气管内施用一起，是依照本发明的优选施用模式。依照本发明的最优选的施用模 式是肌内施用或经口应用。载体任选含有少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物 质。此类材料在采用的剂量和浓度时对于接受者是无毒的，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠 檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其他有机酸或其盐；抗氧化剂例如抗坏血酸；低分子量（少于约 十个残基）（多）肽例如聚精氨酸或三肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲 水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二 糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如Η)ΤΑ ; 糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如聚山梨醇 酯、泊洛沙姆或PEG。
[0081] 包含此类载体的组合物可以通过众所周知的常规方法进行配制。一般地，通过使 药物组合物的组分均匀且紧密地与液体载体或精细分开的固体载体或两者接触来制备制 剂。随后，需要时，使产物成形为所需制剂。
[0082] 这些药物组合物可以以合适剂量施用于对象。剂量方案由主治医师和临床因素决 定。如医学领域中众所周知的，关于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大 小、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和其他同时施 用的药物。关于给定情况的治疗有效量将通过例行实验容易地确定，并且在普通临床医生 或医师的技术和判断内。药物组合物可以用于施用一次或经过延长时间段的有规律施用。 一般地，取决于施用途径，以单一剂量形式的药物组合物的施用应在例如〇. lng/kg体重至 20 μ g/kg体重的Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质的范围内，以及例如0. lng/kg体重至 200 μ g/kg体重的本发明的血红蛋白衍生肽的范围内。然而，对于单一剂量，活性化合物 各自的更优选剂量可以在〇. 05 - 10 μ g/kg体重的范围内，并且甚至更优选在0. 1 - 1 μ g/ kg体重的范围内。更具体而言，对于Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质和血红蛋白衍生 肽分别地，关于i. V.施用的优选单一剂量可以在〇. I - l〇ng/kg体重的范围内，对于s. c.、 i. m.或i. d.施用，在5 - 500ng/kg体重（）的范围内，或对于经口施用最高达20 μ g/kg体 重。在本发明的药剂与进一步的药学活性化合物例如本文其他地方描述的那些组合的情况 下，这些剂量的调整在普通临床医生或医师的技术和判断内。优选地，组分的重量相关在血 红蛋白衍生肽与Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质1:1至100:1的范围内。
[0083] 待用于治疗施用的药物组合物的组分必须是无菌的。无菌性通过经由无菌过滤膜 (例如0. 2微米膜）过滤而容易地完成，尽管本发明并不限于这种达到无菌性的示例性方 法。本发明的药物组合物根据GMP标准依照国家法律和法规要求进行配制。
[0084] 药物组合物的组分通常作为水溶液或用于重构的冻干制剂，贮存于单位或多剂量 容器中，例如密封安瓿或小瓶。作为冻干制剂的例子，l〇-ml小瓶填充有5ml无菌过滤的1 % (w/v)水溶液，并且所得到的混合物是冻干的。通过使用抑菌注射用水重构一种或多种冻干 化合物，来制备输注溶液。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯 合剂和惰性气体等等。取决于药物组合物的预期用途，药物组合物可以包含进一步试剂。
[0085] 如本文使用的，术语"包含"指"由……组成"以及"涵盖"（即，在其他中）两者。 就活性成分一种或多种Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质和一种或多种血红蛋白衍生肽 而言，该术语指仅这两种化合物作为活性化合物的存在（即由……组成），或这两类化合物 和另外药剂的存在（即包含/涵盖）。此类另外的药剂可以例如是本领域已知有效治疗本 文下文描述的疾病的药剂，例如用于预防和/或治疗肿瘤、预防和/或治疗感染、预防和/ 或治疗变态反应、预防和/或治疗年龄相关性免疫失衡、刺激先天性和适应性免疫系统和/ 或减轻辐照的不良副作用的药剂。这些疾病在本文下文更详细地描述。
[0086] 因为本发明的药物制剂依赖上述化合物，即与（a) -种或多种血红蛋白衍生肽组 合的（a) -种或多种Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质，所以优选另外的试剂仅用作补充 物，即以与用作唯一药物时的推荐剂量相比较的降低剂量，以便例如降低由所述进一步试 剂赋予的副作用。
[0087] 如本文使用的，术语"至少"指具体记载的量，以及指超过具体记载的量或数目。 例如，术语"至少一种TLR活化两亲性脂质"还涵盖至少两种、至少三种、至少四种、至少五 种TLR活化两亲性脂质等等。此外，该术语还涵盖刚好两种、刚好三种、刚好四种、刚好五种 TLR活化两未性脂质等等。
[0088] Toll样受体（TLR)活化两亲性脂质是本领域众所周知的。Toll样受体（TLR)最 初通过遗传手段鉴定为传感器，其检测对微生物独特且在微生物分类群中广泛表现的分子 标志；参见例如 Blasius 和 Beutler，''Intracellular Toll-like Receptors.''Immunity 32:305-315(2010)。首先 LPS(TLR4)，随后为 DNA(TLR9)、RNA(TLR3、TLR7、TLR8)、脂肽 (TLR2)，且随后为鞭毛蛋白（TLR5)显示为活化Toll样受体的配体。相应地，能够活化Toll 样受体的两亲性脂质例如LPS或脂肽多年来已经是本领域已知的。此外，脂质LPS和脂 肽/脂蛋白视为两亲性脂质的例子的事实也是本领域众所周知的，参见例如"Properties of Amphiphiles. 〃于：Chemistry and Biological Activities of Bacterial Surface Amphiphiles，编辑 Gerald Shockman 和 Anthony J. fficken, Academic Press，eBook ISBN 9780323151986(2012)，第1-9页。优选地，TLR活化两亲性脂质选自内毒素，或其内毒素活 性部分，和细菌脂肽。
[0089] 术语"内毒素"（在本文中也称为脂多糖，LPS)指一般而言由革兰氏阴性菌产生的 生物活性化合物，并且构成它们可以由其生物学或化学释放的细菌外膜的主要组分。内毒 素是由亲水多糖部分和共价结合的称为脂质A的疏水脂质组分组成的两亲性分子。一般而 言，脂质A组分包含磷酸化的β -1，6-连接的D葡糖胺二糖，其携带最高达七个酰基残基。 然而，在脂肪酸的长度、位置和数目中存在变动。脂质A已显示构成LPS的内毒素要素，因 为LPS的生物学效应通过无多糖脂质A再现（Galanos等人（1985))。该发现以后通过使用 完全化学合成的脂质A和相应的脂质A部分结构例如大肠杆菌（E. coli)脂质A得到证实 (Imoto等人（1987))。此外，此类合成化合物是用于研究LPS和脂质A的结构-活性关系 的基础（Rietschel等人（1987))。相对于细胞因子诱导能力，脂质A生物活性的最低限度 要求是由两个D-葡萄糖构型的己糖胺残基、两个磷酰基和六个脂肪酸组成的分子，如大肠 杆菌脂质A或流感嗜血杆菌（H. influenzae)中存在的（Rietschel等人（1994))。根据关 于结构-活性关系的大量数据，得出结论天然形式的大肠杆菌脂质A代表关于强单核细胞/ 巨噬细胞活化能力的最佳构型。无论是在己糖胺二糖的磷酸化模式还是酰化模式中不同， 大肠杆菌脂质A的所有化学不同的结构或衍生物，在诱导单核因子中活性较小或甚至无活 性。
[0090] 依照本发明应当理解本发明的药物组合物中采用的内毒素可以衍生自任何革兰 氏阴性、携带内毒素的细菌。优选地，所述内毒素衍生自大肠杆菌。
[0091] 术语内毒素的"内毒素活性部分"指展示天然存在的内毒素的至少50%，优选至少 75%，更优选至少90%例如至少95%，且最优选至少100%的内毒素活性的部分。内毒素的 内毒素活性部分可以例如通过LPS的化学或酶促断裂或者通过LPS的（生物）化学修饰而 衍生，由此药学有利部分（基本上）得到维持或改善。此类内毒素活性部分包括通过部分 酶促/水解去糖基化、去磷酸化和脱酰基而产生的片段，或者通过糖基、磷酰基或酰基转移 酶的作用，或通过已知在哺乳动物组织特别是肝中发生