多肽在制备防治脑胶质瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具有抑制脑胶质瘤细胞增殖，延缓 脑胶质瘤生长过程的多肽的潜在医学应用及其制备。
【背景技术】
[0002] 目前对脑瘤缺乏有效治疗手段：手术切除不仅难度高、副作用大，而且容易复发； 血脑屏障的存在使大多数化疗药物难以到达脑病变部位而发挥有效作用；脑肿瘤大多对放 疗不敏感。因此，探索新的脑瘤诊疗手段、有效改善患者生命质量成为神经科学领域基础研 宄工作者和临床医生亟需解决的医学难题之一。
[0003] 脑胶质瘤约占所有脑瘤中发病的30% -80%左右。依据恶变细胞的来源类型不 同，胶质瘤可分为：星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形胶质细胞混合瘤三种。 按组织学形态又可分为：核异质型、有丝分裂型、微血管富集型以及坏死型4个等级。1 级通常预后较好，可通过外科手术完全切除；2级病变加重，病灶开始向周围播散，界限不 清；3-4级属恶性胶质瘤，侵袭及增殖活跃，易转移，预后差。脑胶质瘤中最常见的类型是 恶性星形胶质细胞瘤，包括退行性多形性星形胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM)，GBM发病占50%以上。GBM为4级恶性胶质瘤，多见于老年人，在所有类 型的脑胶质瘤中侵袭性最强、恶性程度最高，平均存活期仅12个月。目前，制约脑胶质瘤诊 疗发展的最大瓶颈是基础研宄不足。作为机体最高级指挥中枢，中枢神经系统肿瘤具有自 身特点，脑胶质瘤异常基因谱有别于其他系统肿瘤，需要加以专科研宄。加强脑胶质瘤的基 础研宄，深入阐明其发生、发展机制，寻找具有关键作用的治疗靶点对改进脑胶质瘤的治疗 现状具有重要的理论和实践意义。
[0004] TROY (又称为TAJ)是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，2000年由Eby等人发现 并克隆，TROY蛋白有416个氨基酸，分子质量为45kDa，（NM_001204458)。TROY的胞外域含 有肿瘤坏死因子受体超家族成员的特征性序列，但是，与其他肿瘤坏死因子超家族成员不 同的是，TROY的胞内域不存在"死亡域"(death domain，DD)。这提示，作为肿瘤坏死因子受 体超家族中的新成员，TROY可能还介导了其他的细胞生物学效应，并有着独特的信号传导 通路。有关TROY在中枢神经系统中的功能主要集中在神经元突起生长抑制方面。2005年， He ZG、Mi S等研宄组报道TROY可以与少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp)等髓鞘相关神经突生长抑制因子（myelin-associated inhibitor factors，MAIFs)受体NgR结合，组成NgR/TROY受体复合物，介导神经突生长抑制作用。这 些主要集中在对神经元中TROY的研宄。然而，TROY在星形胶质细胞、小胶质细胞等中也都 有表达，有关TROY在神经胶质细胞中作用的研宄现在尚处于起步阶段。近年来，通过流行 病学调查和遗传学分析等手段，多个实验室研宄发现，TROY是鼻咽癌、肺癌等的易感基因。
[0005] RKIP(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)属于磷脂酰乙醇胺结 合蛋白家族，广泛存在于各种生物中。RKIP在肿瘤组织中表达低，肿瘤转移病灶中的表达又 低于原发病灶。RKIP在某些细胞系中被证实具有抑制细胞生长和肿瘤转移以及促进凋亡等 重要功能。RKIP可以与Raf-I结合，从而抑制MPK信号转导通路，并参与了对G蛋白偶联 受体信号通路和NF-kB信号通路的调控。已有文献表明，RKIP与肿瘤关系密切且作用很重 要。因此，探讨干扰TROY/RKIP间结合对脑胶质瘤的何影响对研宄它们作为脑胶质瘤治疗 靶点的可能性具有重要的理论和实践意义。
[0006] 目前尚无有关通过多肽抑制TROY受体活性来缓解脑胶质瘤病变过程的相关报 道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有抑制TROY受体下游信号通路活性的多肽，该多 肽可以用于制备延缓脑胶质瘤发生、发展过程的药物。
[0008] 本发明的第一方面，是提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ IDN0:1所示。
[0009] CCQCRRDSVQTCGPVRLLPSMCCEEACSPNPATLGCGVHSAASLQARNAGPAGEMVPTFFGSLTQSICG EFSDAWPLMQNPMGGDNISFCDSYPELTGEDIHSLNPELESSTSLDSNSSQDLVGGAVPVQSHSENFTA(SEQ ID N0:1)
[0010] 该多肽为138个氨基酸的肽段（SEQ ID NO: I)，位于人TROY蛋白序列细胞内域第 234到371位氨基酸。具有阻断TROY受体与下游信号分子RKIP结合，减低TROY介导的 NF-kB激活，抑制脑胶质瘤细胞增殖的作用。
[0011] 申请人对TROY蛋白的416个氨基酸进行截取，分别对194-416、194-390、194-371、 194-350、234-416、256-416、234-371作了与下游信号分子RKIP结合实验，结果发现 234-371区域为可以与RKIP结合的最小区域，此区域可以有效阻断TROY与RKIP分子间的 体内外结合。实验证实本发明的多肽为最短的可以有效阻断TR0Y/RKIP结合的功能域。
[0012] 本发明的第二方面，是提供了上述的多肽在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应 用。
[0013] 本发明的多肽可以按常规药剂学制备成注射剂。
[0014] 本发明经裸鼠脑胶质瘤细胞种植实验检测，结果表明，如SEQ ID NO: 1所示的多肽 分子能延缓皮下种植的脑胶质瘤细胞的发育。
[0015] 本发明的第三方面，是提供了上述的多肽在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应 用，所述的药物是指能够抑制、或下调上述多肽的表达量的试剂。
[0016] 所述的能够抑制、或下调上述多肽的表达量的试剂是上述多肽的siRNA、shRNA或 包含siRNA、shRNA的重组载体。
[0017] 进一步地，本发明提供了所述的能够抑制、或下调上述多肽的表达量的ShRNA，所 述的shRNA序列如SEQ ID NO: 7所示：
[0018] 5, -TCAACGTCTTTGGATTCAActcgagTTGAATCCAAAGACGTTGA-3' （SEQ ID N0:7)
[0019] 本发明还提供了一种含有上述shRNA的重组载体，所述的重组载体可采用慢病毒 载体GVl 18。
[0020] 体外实验中可采取脂质体介导法转染shRNA ;体内实验中可采用直接注射复制缺 陷慢病毒携带目的DNA至损伤部位等，本发明今后临床应用的给药方式可包括但不限于： 直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌 携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹 蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法等（Hickman MA, Malone RW, Lehmann-Bruinsma K，et al. Gene expression following direct injection of DNA into liver. Hum Gene Ther. 1994 ;12:1477-1483 ;Patil SD，Rhodes DG，Burgess DJ.DNA-based therapeutics and DNA delivery systems: A comprehensive review. AAPS J.2005 ；7 (I):61-77 ； Boulikas T. Nuclear localization signal peptides for the import of plasmid DNA in gene therapy. Int J Oncol. 1997 ；1:301-309)〇
[0021] 本发明提供的多肽、ShRNA具有在制备防治脑胶质瘤病变过程中良好的应用前景。
【附图说明】
[0022] 图I. TAT-TROY(231-371氨基酸）结构示意图，为了促进多肽分子进入胞浆， 在TROY(234-371氨基酸）138多肽分子的N末端融合表达一段TAT穿膜肽（Schwarze SR, Ho A,Vocero-Akbani A,Dowdy SF.In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 1999Sep3 ； 285(5433) :1569-72.)。
[0023] 图2 TAT-TROY (231-371氨基酸）干扰肽显著减弱TROY与RKIP间的结合，(λ I μ M 的TAT-TROY干扰肽加入GST-TROHCD与His-RKIP蛋白孵育体系中，GST Pull-down检测 TROY与RKIP间的结合。A图GST Pull-down结果显示TAT-TROY干扰肽显著减弱TROY与 RKIP间的结合；B图为灰度扫描对A图结果进行半定量，进一步确证上述结果。
[0024] 图3 TAT-TROY (231-371氨基酸）干扰肽转导进入U87细胞，0· 1 μ M的TAT-TROY 干扰肽加入U87人脑胶质瘤细胞培养体系中，以PBS为对照组。TAT抗体对上述细胞免疫荧 光染色显示，TAT-TROY干扰肽可以顺利转导进入U87细胞。
[0025] 图4 TAT-TROY(231-371氨基酸）干扰肽显著减低U87细胞中NF-kB活性，(λ 1 μΜ 的TAT-TROY干扰肽加入U87细胞培养体系中，以PBS为对照组。孵育12小时后裂解细胞， 检测NF-kB活性，结果显示，TAT-TROY干扰肽可以显著减低U87细胞中NF-kB活性。
[0026] 图5 TAT-TROY(231-371氨基酸）干扰肽显著减弱U87细胞裸鼠皮下成瘤，将 2X 106个稳定表达绿色荧光蛋白的U87细胞皮下注射至裸鼠下肢背外侧皮下，每组5只老 鼠。之后，隔天腹腔注射2mg/kg的TAT-TROY干扰肽，以TAT蛋白为对照。肿瘤细胞皮下种 植35天后，体视荧光显微镜下拍照。A图结果显示，与对照组相比较，腹腔注射TAT-TROY干 扰肽组裸鼠成瘤显著减弱。实验至少重复5次。B图，拍照完成后，处死老鼠，手术剥取病变 部位团块，确证其为实体瘤组织。与对照组相比，**P〈〇. 01。结果表明TAT-TROY干扰肽可 以显著减弱U87细胞在裸鼠皮下成瘤。
[0027] 图6 TROY ShRNA干扰序列显著减弱U87细胞中TROY表达，A) Western blot检测 稳定表达TROY ShRNA干扰序列的U87细胞中的TROY表达；B)右图为灰度扫描对A图结果 进行半定量。
[0028] 图7 ShRNA基因敲减TROY表达显著减缓U87细胞裸鼠皮下成瘤，将2X106个 稳定表达TROY ShRNA和绿色荧光蛋白的U87细胞皮下注射至裸鼠下肢皮下，每组5只老 鼠。肿瘤细胞皮下种植35天后，体视荧光显微镜下拍照。A图结果显示，与对照组相比较， TROY-ShRNA干扰组裸鼠成瘤显著减弱。B图，拍照完成后，处死老鼠，手