一种高效表达多肽PA1b的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效表达多肽PA1b的方法以及由上述方法制备的多肽PA1b在治疗糖尿病中的应用。

背景技术：

豌豆白蛋白1b(pea albumin lb，PAlb)为含37个氨基酸的单链肽，分子量为3，742Da，第3,7,15,20,22和32位的氨基酸均为半胱氨酸，由3对二硫键构成胱氨酸结模体。该肽在植物体内参与生长和代谢的调节，其作用模式与动物体内胰岛素和胰岛素样生长因子作用类似。它在大豆种子中可结合7S Bg蛋白，7S Bg蛋白又可以结合动物胰岛素和胰岛素样生长因子，故PA1b又名为豆类胰岛素Leginsulin。

糖尿病是一种以高血糖为典型特征的代谢综合征。据WH02016年报告，全球糖尿病患者己达到4.22亿，中国糖尿病人己达到1.3亿，占人口总数的9.4。据WHO估计，2005-2015年，中国用于糖尿病及相关心血管疾病导致的经济损失达5577亿美元。虽然糖尿病的治疗与预防己得到全球高度重视，但是近年的多项调查表明，无论是欧美发达国家还是发展中国家，糖尿病控制状况均不容乐观。

目前糖尿病的治疗药物主要集中在胰岛素、磺脲类药物、GLP-1受体激动剂、DDP-W抑制剂、二甲双胍类、噻唑烷二酮类等。遗憾的是这些药物都存在比较明显的缺点，如二甲双胍类易导致乳酸血症，噻唑烷二酮类存在肝毒性以及骨质丢失等副作用，磺脲类药物长期服用易引起低血糖，而长期服用DDP-W抑制剂容易产生咳嗽，胰岛素则具有不能口服、使用不方便等先天缺陷。

近来，NMR研究显示，豆类胰岛素与胰岛素，Bg蛋白与胰岛素受体在空间结构上有相似之处。那么PA1b是否具有胰岛素样调节糖代谢功能？引起了研究者的兴趣。特别的是，这个植物多肽同时在动物胃肠道内被发现存在，它是否是新的类似肠促胰岛素多肽激素，同样也是令众多研究者感兴趣的问题。CN105944103A发现将具有降糖功能的大豆活性肽PAlb与其他降糖和/或降脂成分复配后不仅大大提高了降糖效果，减少用药剂量，而且复配药物具有保护胰岛细胞的功能；豆类胰岛素(PAlb)基因克隆、表达及融合蛋白纯化，《华中科技大学硕士学位论文》，杜雯，2005，第一次用基因重组法制备PA1b，为深入研究PAIb的功能，开发“胰岛素型”口服降糖药物提供了基础。

但现有的PA1b蛋白表达的方法还存在缺陷，其表达效率低下，纯度不高，质量不稳定，因此，开发高效稳定表达大豆活性肽PA1b的方法成为研究的热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效表达多肽PA1b的方法，以解决现有技术所存在的表达效率低下的问题，本发明的方法具有表达稳定性好、安全性高、成本低以及易大规模生产；另外，由本方法制备的多肽PA1b在应用于治疗糖尿病中取得了良好的效果。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

一种高效表达多肽PA1b的方法，包括如下步骤：

(1)目的基因PA1b的合成：查找PA1b基因序列，设计上下游引物；并以豌豆cDNA文库为模板，以上游引物、下游引物进行PCR扩增获得PA1b目的基因片段；

(2)PA1b基因和载体的连接：将目的基因片段PA1b和载体PUSCN1分别用限制性内切酶BamHI和XhoI酶进行双酶切，然后通过T4连接酶将酶切后的基因片段PA1b和载体PUSCN1进行连接获得重组质粒PUSCN1-PA1b；

(3)重组质粒PUSCN1-PA1b的转化：将步骤(2)获得的重组质粒PUSCN1-PA1b采用热激转化的方式导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行培养，之后提取重组质粒PUSCN1-PA1b；

(4)重组质粒的酶切、测序鉴定：将提取的重组质粒用BamHI和XhoI酶切，37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；酶切结果正确，将质粒送往测序机构进行鉴定以确定已连接的片段为所需的目的片段；

(5)293F(人胚肾悬浮细胞)细胞的转染：在步骤(4)的鉴定结果通过后，将所述重组质粒PUSCN1-PA1b导入到293F(人胚肾悬浮细胞)细胞进行转染，转染结束后，细胞继续培养7天，之后6000RPM离心10min并收取上清，镍离子柱亲和纯化PA1b蛋白，其纯度达到98％，经鉴定即为多肽PA1b。

所述PCR扩增的条件为：95℃5min预变性，94℃30s、54℃30s、72℃50s，40个循环，72℃延伸10min。

所述步骤(5)中转染前细胞密度调为2.5×106/mL。

所述转染是在如下条件下进行：细胞：质粒：PEI的比例＝1:3:9，转染的时间为7天。

所述步骤(5)中蛋白的鉴定过程为：将蛋白湿转入PVDF膜，然后孵育一抗，封闭之后再孵育二抗，利用ECL Reagent与二抗上的辣根过氧化物酶反应，产生发射波长为428nm的光波，此光经X光片感光记录下来，结果显示表达蛋白是多肽PA1b。

另外，本发明还要求保护由上述方法制备得到的多肽PA1b以及该多肽PA1b在治疗糖尿病中的应用。

本发明的主要发明要点在于首次采用人源哺乳动物细胞成功表达PA1b，哺乳动物细胞表达系统能够为重组蛋白提供最接近于天然状态的翻译后修饰，在蛋白表达过程中会形成接近天然蛋白的蛋白质折叠和聚合，具备活性蛋白所必须的空间结构和修饰。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。

本发明的技术效果为：(1)采用人源哺乳动物细胞进行PA1b蛋白的表达，由于其人源关系近，蛋白修饰准确，具有很高的转染效率；(2)本发明的方法表达水平高且是分泌表达，表达量可高达1-3g/L；(3)本发明采用自主改进的载体PUSCN1，并且在自主表达载体上添加分泌信号肽或标签，以促进目的蛋白的分泌表达易于纯化，一方面增加了WPRE元件(土拨鼠肝炎转录后修饰调控元件)，增强了外源基因的表达；其次，N端增加了人的IL2的信号肽(其氨基酸序列-MYRMQLLSCI ALSLALVTNS，碱基序列

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT)；(4)表达的蛋白质量稳定，产品均一；(5)人源哺乳动物细胞耐受剪切力强，可大规模生产；(6)293F细胞为人源细胞，不合成分泌致病致癌物质，安全性强；(7)可大规模生产，成本低；(8)本发明多肽PA1b蛋白能够应用于制造治疗糖尿病的药物和食品中，其制作成本比胰岛素低，并且比胰岛素方便，可发展为口服型，无毒副作用，在血糖水平低于生理水平是不发挥降血糖作用。

附图说明

图1为测定的PA1b蛋白序列图；

图2为载体PUSCN1的信息图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述：

实施例1

一种高效表达多肽PA1b的方法，包括如下步骤：

(1)目的基因PA1b的合成：查找PA1b基因序列，设计上下游引物；并以豌豆cDNA文库为模板，以上游引物、下游引物进行PCR扩增获得PA1b目的基因片段；所述上游引物为上游引物为5-CGCGGATCCGCAAGCTGC-3，其酶切位点为BamHI；下游引物为

5-CCGCTCGAGTTCCAGATGGATG-3，其酶切位点为XhoI；所述PCR扩增的条件为：95℃5min预变性，94℃30s、54℃30s、72℃50s，40个循环，72℃延伸10min；PCR反应的体系为：10×Buffer 1μl，合成PA1b基因1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μL，高保真PFU酶0.5μl，dNTP 1μl，双蒸水5.5μl。

(2)PA1b基因和载体的连接：将目的基因片段PA1b和载体PUSCN1分别用限制性内切酶BambI和XhoI酶进行双酶切，然后通过连接酶将酶切后的基因片段PA1b和载体PUSCN1进行连接获得重组质粒PUSCN1-PA1b；

(3)重组质粒PUSCN1-PA1b的转化：将步骤(2)获得的重组质粒PUSCN1-PA1b采用热激转化的方式导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行培养，之后提取重组质粒PUSCN1-PA1b；

(4)重组质粒的酶切、测序鉴定：将提取的重组质粒用BamHI和XhoI酶切，37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果；酶切结果正确，将质粒送往测序机构进行鉴定以确定已连接的片段为所需的目的片段；

(5)在步骤(4)的鉴定结果通过后，将所述重组质粒PUSCN1-PA1b导入到293F(人胚肾悬浮细胞)细胞进行转染，转染结束后离心收取上清，镍离子柱亲和纯化PA1b蛋白，其纯度达到98％，经鉴定即为多肽PA1b；转染前细胞密度调为2.5×106/mL；所述转染是在如下条件下进行：细胞：质粒：PEI的比例＝1:3:9，转染的时间为7天；另外，蛋白的鉴定过程为：将蛋白湿转入PVDF膜，然后孵育一抗，封闭之后再孵育二抗，利用ECL Reagent与二抗上的辣根过氧化物酶反应，产生发射波长为428nm的光波，此光经X光片感光记录下来，结果显示表达蛋白是多肽PA1b。

(6)多肽活性的检测：在24孔板上加BXPC-3(人原位胰腺腺癌细胞)细胞悬液，密度约为1×105/孔，细胞悬液500μl/孔；5％CO2，37℃孵育24h；换新鲜加药的生长培养基，按0、10、25、50μM浓度加入细胞培养液中5％CO2，37℃孵育30min；向各孔加入1μg/m L的LPS，5％CO2，37℃孵育24h；使用碧云天的一氧化氮检测试剂盒，步骤参考试剂盒说明书：检测不同浓度PA1b培养细胞BXPC-3的NO含量差异，鉴定多肽PA1b活性,在PA1b浓度达到50μM时差异显著。

实施例2

实验测定多肽PA1b在动物糖尿病模型中的效果：

(1)动物模型的建立与分组

2型糖尿病模型大鼠构建：取2月龄SD大鼠，给予高糖高脂饲料喂养1个月，然后腹腔注射20mg/kg四氧嘧啶(STZ)，继续高脂饲料喂养，监控其血糖变化。

(2)动物分组：含98％Palb的大豆活性多肽为基准量，中等剂量为5倍基准量多肽蛋白，高剂量为30倍基准量多肽蛋白。造模成功后，将模型鼠分为阳性对照组、基准量(低剂量)Palb组、中等剂量Palb组、高剂量Palb组、茶多糖组、茶多酚组和二甲双胍组。

(3)药物治疗：各实验组分别给予对应的药物进行治疗：低剂量组灌胃给予5mg/kg/d纯度为98％Palb的大豆活性多肽，中剂量组灌胃给予25mg/kg/d纯度为98％Palb的大豆活性多肽，高剂量组灌胃给予100mg/kg/d纯度为98％Palb的大豆活性多肽，茶多糖组灌胃给予15mg/kg/d99％茶多糖，茶多酚组灌胃给予15mg/kg/d 95％茶多酚，二甲双胍组灌胃给予100mg/kg/d二甲双胍。

(4)效果评价：分别于给药前、给药后1周、给药后2周、给药后3周以及给药后4周检测各实验组大鼠血糖值。结果见表1。

其测试结果如下表1：

由表1可以看出，不同剂量组大豆活性多肽药物均能不同程度降低模型鼠的血糖，其中高剂量大豆活性多肽组最为明显。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。