一种MC1R基因载体及其构建方法与流程

本发明属于基因载体技术领域，尤其涉及一种MC1R基因载体及其构建方法。

背景技术：

动物的毛色或羽色作为一个重要的经济性状，在确定品种纯度和亲缘关系方面发挥着重要的作用。研究发现，动物毛色或羽色之所以不同，是因为黑色素的种类和分布不同造成的。黑素皮质素受体1(melanocortin 1 recptor，MC1R)，是控制动物黑色素形成的主要基因，由一个外显子组成，在黑色素细胞中表达，与天然配体a-MSH相互作用，通过由G蛋白耦合的cAMP信号通路，来调节黑色素细胞内的一系列级联反应，最终经多巴或多巴铬合成各自的衍生物即褐黑素细胞和真黑色素，从而决定动物的毛色。然而，目前在鸟类上，关于MC1R影响黑色素沉积的分子机理尚不明确，在其基因功能学方面，关于MC1R基因敲除及敲除后对羽色性状的影响等相关研究尚未见报道。CRISPR/Cas9系统是细菌在噬菌体长期的选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制之一。在菌体内，CRISPR簇在其前导区的调控下转录成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9参与下加工成成熟的crRNA，引导crRNA/tracrRNA/Cas9复合体识别结合外源DNA特定序列，剪切DNA双链，从而沉默外源基因的表达。CRISPR/Cas9系统被开发成了一种新型的基因打靶系统。相对于较早的RNAi、ZFN和TALEN系统，这种新型打靶系统具有操作简单、成本低、效率高、可同时沉默任意数量基因等优点。

目前在鸟类上，关于MC1R影响黑色素沉积的分子机理尚不明确，在其基因功能学方面，关于MC1R基因敲除及敲除后对羽色性状的影响等相关研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种MC1R基因载体及其构建方法，旨在针对家鸡MC1R基因进行定向敲除，为对家鸡的羽毛毛色进行人工调控奠定基础。

本发明是这样实现的，一种MC1R基因载体，可用于家鸡MC1R的基因定向敲除，适用于鸡羽色等科研领域，进一步可适用于鸡羽色性状的人工控制，所述MC1R基因载体包括MC1R-neo和MC1R-GFP；所述MC1R-neo核苷酸序列为SEQ ID NO：1；所述MC1R-GFP核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一目的在于提供一种所述MC1R基因载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

步骤一，引物退火：1ul F-Oligo(100uM)，1ul R-Oligo(100uM)，8ul YSY oligo退火缓冲液，以上溶液混合于PCR管内，在PCR仪中以每分钟1.5℃逐渐从95℃降至22℃；

步骤二，连接：0.5ul退火产物，1ul YSY线性化三合一CRISPR/Cas9n质粒，1ul T4连接酶，2ul 5*T4Buffer，5.5ul Milli Q；

步骤三，转化：室温15min后用pfu≥10⁸的大肠杆菌DH5a感受态细胞进行转化；

步骤四，转化子验证：转化涂板后挑取单克隆进行10ul体系菌液PCR验证；

步骤五，经PCR初步鉴定后进行测序；

步骤六，质粒提取：菌液37℃过夜培养，无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，并采用微量紫外分光光度计测定质粒浓度。

进一步，所述转化涂板后挑取单克隆进行10ul体系菌液PCR验证，具体包括：挑取单克隆0.5ul菌液，0.5ul YSY验证正向引物，0.5ul R-Oligo，5ul Mastermix，3.5ul MilliQ；PCR反应条件为：1)：95℃预变性2mim；2)：94℃变性30s；3)：56℃退火30s；4)：72℃延伸30s；步骤2)到步骤4)运行35个循环；5)：72℃再延伸10min；6)：4℃保存。

进一步，所述引物包括：

F-MC1R-gRNA-L1：CACCGAAGGAGAGGGAGGACACGA；

R-MC1R-gRNA-L1：AAACTCGTGTCCTCCCTCTCCTTCC；

F-MC1R-gRNA-R1：CACCGCTTCCTGGGGGTCATCGCCG；

R-MC1R-gRNA-R1：AAACCGGCGATGACCCCCAGGAAG。

进一步，所述质粒浓度为：

pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-L2-SV40-Neo质粒：4ug浓度:190ng/ul；

pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-R2-EF1a-eGFP质粒：4ug浓度:184ng/ul。

本发明提供的MC1R基因载体及其构建方法采用CRISPR/cas9系统，设计MC1R基因的sgRNA片段，化学合成sgRNA核苷酸序列，构建同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-sgRNA，连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，最后对转化子进行验证；酶切和测序鉴定证明MC1R基因敲除载体构建正确。本发明采用CRISPR/Cas9构建的载体，可以定向敲除鸡MC1R基因，因而可为后续获得鸡MC1R基因缺失型细胞株、生产MC1R基因缺失转基因鸡等相关研究奠定基础。本发明通过构建MC1R基因敲除载体，为后续采用该载体制备MC1R基因缺失细胞株，来进一步研究MC1R基因功能提供基础。

本发明采用CRISPR/Cas9系统构建MC1R基因敲除载体，方法简单快捷，只需针对该基因敲除位点设计一个长约20bp左右的sgRNA，然后连接通用的Cas9基因即可，而采用ZFNs或TALENs进行基因敲除，对每个基因位点编辑都需要设计和组装两个核酸酶，构建技术难度较大、构建组装时间较长。因此，与传统的ZFNs、TALENs等基因敲除技术比较而言，采用CRISPR/Cas9构建基因敲除载体更为简单快捷，便于进一步推广和应用于后续实验。

与ZFN和TALEN这两种人工核酸酶相比，CRISPR/Cas9系统中的Cas9作为切口酶，具有单链切割活性，可以在特定位置制造单链切口，这样基本不会引起非同源末端连接，从而高效地介导外源基因的定点敲入，或对基因组进行点突变，大大降低了非同源末端连接所带来的风险。

本发明利用RNA导向的CRISPR-Cas9系统形成双切口，在未影响靶向切割效率的前提下大大降低了脱靶效应，提高基因敲除效率，相对于传统的单切口敲除载体，其敲除效率可提高20％以上。

附图说明

图1是本发明实施例提供的MC1R基因载体的构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的PCR验证克隆电泳图片示例示意图；

图中：Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，从下到上依次为100bp，250bp，500bo，750bp，1000bp，3000bp，5000bp；2:阴性对照；3-6:MC1R-gRNA-Rg1克隆。

图3是本发明实施例提供的PCR验证克隆电泳图片示例示意图；

图中：Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，从下到上依次为100bp，250bp，500bo，750bp，1000bp，3000bp，5000bp；2:阴性对照；3-6:MC1R-gRNA-Lg1克隆。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例的MC1R基因载体包括MC1R-neo和MC1R-GFP；所述MC1R-neo核苷酸序列为SEQ ID NO：1；所述MC1R-GFP核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：1为：

TGGCTTTATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAAGGAGAGGGAGGACACGAGTTTTAGAGCTAGAA；

SEQ ID NO：2为：

TGGCTTTATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTTCCTGGGGGTCATCGCCGGTTTTAGAGCTAGA。

如图1所示，本发明实施例的MC1R基因载体的构建方法包括以下步骤：

S101：引物退火：1ul F-Oligo(100uM)，1ul R-Oligo(100uM)，8ul YSY oligo退火缓冲液，以上溶液混合于PCR管内，在PCR仪中以每分钟1.5℃逐渐从95℃降至22℃；

S102：连接：0.5ul退火产物，1ul YSY线性化三合一CRISPR/Cas9n质粒，1ul T4连接酶，2ul 5*T4Buffer，5.5ul Milli Q；

S103：转化：室温15min后用大肠杆菌DH5a感受态细胞(pfu≥10⁸)进行转化；

S104：转化子验证：转化涂板后挑取单克隆进行10ul体系菌液PCR验证；

0.5ul菌液，0.5ul YSY验证正向引物，0.5ul R-Oligo，5ul Mastermix，3.5ul MilliQ；PCR反应条件为：1)：95℃预变性2mim；2)：94℃变性30s；3)：56℃退火30s；4)：72℃延伸30s；步骤2)到步骤4)运行35个循环；5)：72℃再延伸10min；6)：4℃保存；

S105:经PCR初步鉴定后进行测序；

S106：质粒提取：菌液37℃过夜培养，无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，并采用微量紫外分光光度计测定质粒浓度。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料和方法

1.1材料

Trans2K Plus DNA Marker购自全式金生物技术有限公司，线性化三合一CRISPR/Cas9n质粒购自南京尧舜禹公司，大肠杆菌DH5a感受态细胞、T4连接酶、无内毒素质粒大提试剂盒均购自天根生化有限公司。

1.2方法

1.2.1 sgRNA靶点确定和引物设计

根据鸡MC1R基因(GenBank:KF379749.1)，找到CDS序列并分析其结构，根据该基因结构确定敲除位点，选择外显子序列输入到软件中，得到gRNA序列。并根据设计生成的2个sgRNA，设计并合成对应的2对引物Oligo如下：

SEQ ID NO：3 F-MC1R-gRNA-L1：CACCGAAGGAGAGGGAGGACACGA；

SEQ ID NO：4 R-MC1R-gRNA-L1：AAACTCGTGTCCTCCCTCTCCTTCC；

SEQ ID NO：5 F-MC1R-gRNA-R1：CACCGCTTCCTGGGGGTCATCGCCG；

SEQ ID NO：6 R-MC1R-gRNA-R1：AAACCGGCGATGACCCCCAGGAAG；

1.2.2 CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建

引物退火：1ul F-Oligo(100uM)，1ul R-Oligo(100uM)，8ul YSY oligo退火缓冲液，以上溶液混合于PCR管内，在PCR仪中以每分钟1.5℃逐渐从95℃降至22℃。

连接：0.5ul退火产物，1ul YSY线性化三合一CRISPR/Cas9n质粒，1ul T4连接酶，2ul 5*T4 Buffer，5.5ul Milli Q。

转化：室温15min后用大肠杆菌DH5a感受态细胞(pfu≥10⁸)进行转化。

转化子验证：转化涂板后挑取单克隆进行10ul体系菌液PCR验证。

0.5ul菌液，0.5ul YSY验证正向引物，0.5ul R-Oligo，5ul Mastermix，3.5ul MilliQPCR反应条件：Seg1：95℃预变性2mim；Seg2：94℃变性30s；Seg3：56℃退火30s；Seg4：72℃延伸30s；Seg2to Seg4运行35个循环；Seg5：72℃再延伸10min；Seg6：4℃保存。

经PCR初步鉴定为阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

1.2.3质粒提取

菌液37℃过夜培养，无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，并采用微量紫外分光光度计测定质粒浓度。

2.结果

2.1 sgRNA设计

将sgRNA识别位置设在7tm_1相对应的位置上(60aa之后或总120aa以后)

在U6启动子驱动下预计的sgRNA转录本RNA序列分别为：

SEQ ID NO：7为：MC1R-gRNA-Lg1

GAAGGAGAGGGAGGACACAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU；

SEQ ID NO：8为：MC1R-gRNA-Rg1

GCUUCCUGGGGGUCAUCGCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU。

2.2 PCR验证阳性克隆电泳图片如图2和图3所示。

2.3送检测序结果

将之前验证正确的阳性克隆菌液送至金斯瑞生物技术有限公司测序，测序部分序列比对结果具体如下：

2.3.1 pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-L2-SV40-Neo

通过对比，其同源性达到100％。

2.3.2 pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-R2-EF1a-Egfp

其同源性达到100％。因此，通过以上序列比对，可确定目标质粒构建成功。

2.4鸡MC1R基因的敲除质粒对提取及浓度测定：

pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-L2-SV40-Neo质粒：4ug浓度:190ng/ul。

pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-R2-EF1a-eGFP质粒：4ug浓度:184ng/ul。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>安徽大学

<120> 一种MC1R基因载体的构建方法

<160> 8

<210> 1

<211> 69

<212>DNA

<213> 鸡MC1R

<400> 核苷酸序列

TGGCTTTATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAAGGAGAGGGAGGACACGAGTTTTAGAGCTAGAA

<210> 2

<211> 69

<212>DNA

<213> 鸡MC1R

<400>核苷酸序列

TGGCTTTATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTTCCTGGGGGTCATCGCCGGTTTTAGAGCTAGA

<210> 3

<211> 24

<212>RNA

<213> F-MC1R-gRNA-L1

<400>核苷酸序列

CACCGAAGGAGAGGGAGGACACGA

<210> 4

<211> 25

<212>RNA

<213> R-MC1R-gRNA-L1

<400>核苷酸序列

AAACTCGTGTCCTCCCTCTCCTTCC

<210> 5

<211> 25

<212>RNA

<213> F-MC1R-gRNA-R1

<400>核苷酸序列

CACCGCTTCCTGGGGGTCATCGCCG

<210>6

<211> 24

<212>RNA

<213> R-MC1R-gRNA-R1

<400>核苷酸序列

AAACCGGCGATGACCCCCAGGAAG

<210>7

<211> 103

<212>RNA

<213>鸡MC1R

<400>核苷酸序列

GAAGGAGAGGGAGGACACAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU

<210>8

<211> 103

<212>RNA

<213>鸡MC1R

<400>核苷酸序列

GCUUCCUGGGGGUCAUCGCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU