一种具有热疗效应的基因载体的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有热疗效应的基因载体的制备方法，属于生物工程技术领域。首先制备金纳米笼；然后采用4，4’?二硫代二丁酸、1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N?羟基丁二酰亚胺和聚乙烯亚胺发生酰胺化反应，得到不溶于水的似凝胶材料，将似凝胶材料与巯基乙醇反应得到一端带有巯基、另一端接枝聚乙烯亚胺的阳离子聚合物；最后将得到的金纳米笼与制备的阳离子聚合物混合，对金纳米笼进行表面修饰，再经过离心和清洗后，即得到具有热疗效应的基因载体。本发明制备的载体与质粒DNA形成的复合物具有细胞毒性低，转染效率高等优点，同时该载体还具有热效应，可以实现热疗和基因治疗的双重效果。
【专利说明】
一种具有热疗效应的基因载体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种新型的具有热疗效应的基因载体的制备方法，具体涉及一种以金 纳米笼作为母体，表面接枝修饰阳离子聚合物聚乙烯亚胺来构建新型非病毒基因载体的方 法。这种载体具有基因治疗和热治疗的双重疗效，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 基因治疗是指在基因水平上对遗传缺陷进行纠正，主要通过引入外源基因以纠正 或补偿基因的缺陷，关闭或抑制基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。它作为一种全 新的、革命性的治疗手段，其临床应用范围不断被扩大，主要体现在癌症治疗研究上。为提 高基因药物的稳定性、靶向性和转染效率，研究者大多都基于病毒如腺病毒、逆转录病毒等 构建基因载体。虽然采用病毒作为载体，其转染效率高，但仍存在自身免疫原性和生物安全 性等问题。例如，世界上第一个基因新药一一Gendi Cine("今又生"），就是以腺病毒作为p53 基因载体，临床使用过程中病人会出现寒战、高热和应激性过敏等不良反应，同时对免疫抑 制的患者来说，有可能引起更严重后果，如诱导基因突变致癌或致死等。正是由于病毒载体 的这些缺点驱使人们迫切寻找一种非病毒载体来负载基因。
[0003] 常见的非病毒载体包括阳离子脂质体、阳离子聚合物和阳离子多肽分子或蛋白质 等。非病毒载体依赖于DNA与阳离子聚合物或质粒之间的非共价键组装来负载基因。其中， 阳离子脂质体具有类似细胞膜的双层结构，可与细胞膜上阴离子成分"电子配对"，短暂性 破坏细胞膜而成功将基因载入细胞内。阳离子聚合物通过静电吸附带有负电荷的DNA来负 载基因。基于阳离子聚合物的载体其制备的可操作性强，可以在同一个分子上加上多个功 能基团使其在基因载体方面有着广泛的应用。现有的聚阳离子其效能低，且会导致生理缺 陷，因此需对其进行修饰。
[0004]聚乙烯亚胺（（英文简称PEI))作为一种阳离子聚合物，通过静电作用来吸附带有 负电荷的DNA，支化结构的PEI的结合位点较多，可以携带大量的DNA，且PEI质子海绵效应显 著，囊泡中带有正电荷的PEI通过不断吸附细胞质中的H+，由于渗透压的改变，导致包有基 因载体的囊泡破裂，将载体释放到细胞质中。研究发现，如果将聚乙烯亚胺(PEI)引入到基 因转染中，可以很好地解决非病毒载体转染效能低的问题。研究发现，PEI的基因转染效率 及毒性与分子量很大关系，在相同浓度下，未经修饰的PEI-2000分子量其转染效率比PEI-2500分子量低两个数量级。当对PEI-2000进行烷基化修饰后，其转染效率比PEI-2500高5 倍。而将烷基化修饰后的PEI-2000与金纳米粒子偶联，这种偶联物的转染效率比PEI-2500 高6倍。
[0005] 金纳米颗粒由于具有优良的光学性能，在特殊波长对光进行吸收和散射。这种特 殊的局域表面等离子体共振(LSPR)现象可以增强某些特定组织的光信号特征，从而提高成 像的对比度，因此在医学光成像上具有潜在的应用前景。
[0006] 球形的金纳米颗粒其SPR峰主要在可见光范围内，这种光对组织穿透深度较浅，而 金纳米笼的SPR峰位置可通过调节银纳米立方体与氯金酸之间的摩尔比得到的不同刻蚀程 度及表面孔隙率和孔径的金纳米笼，从而实现在近红外区700-1200nm内有特征吸收。由于 近红外区的光穿透深度较深，在这个波段范围中，光波在血液和软组织中的吸收都处于最 小，有利于深层组织病变的检测和治疗。
[0007] 另外金纳米笼状颗粒有较大的吸收截面积，可以达到3.48 Xl(T14m2,能有效地吸 收光子，并把光能转化为热能使温度升高，从而把癌细胞原位杀死。金纳米笼状颗粒的毒性 相对较低，颗粒表面容易被生物分子所修饰，金纳米笼制备过程中及纳米笼表面包覆PVP通 过Au-N配位键从而实现稳定包覆，由于Au-s共价键比Au-N配位键的结合力强，所以金表面 容易被带有-SH的有机物链修饰，从而实现金纳米笼表面功能化。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种具有低细胞毒性、高基因转染效率且具备热疗功能的 表面接枝阳离子聚合物的金纳米笼基因载体的制备方法。
[0009 ] -种具有热疗效应的基因载体的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 1)首先制备金纳米笼(A);
[0011] 2)然后采用4,4'_二硫代二丁酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N- 羟基丁二酰亚胺和聚乙烯亚胺(PEI)发生酰胺化反应，得到不溶于水的似凝胶材料(B)，将 似凝胶材料(B)与巯基乙醇反应得到一端带有巯基、另一端接枝聚乙烯亚胺的阳离子聚合 物(C);
[0012] 3)然后将得到的金纳米笼(A)与制备的阳离子聚合物(C)混合对金纳米笼进行表 面修饰，再经过离心和清洗后，即得到本发明具有热疗效应的基因载体(D)。
[0013] 本发明中，制备金纳米笼的优选方法为多元醇法，即先通过多元醇法制备银纳米 立方体，然后以此作为模版，制备金纳米笼。
[0014] 本发明优选的金纳米笼的制备方法主要包括以下步骤：
[0015] (1)通过多元醇法制备银立方体，将制备的银立方体离心处理后分散在三蒸水中， 得到银纳米立方体的分散液，浓度为6-8nM;将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于三蒸水中，配置成 浓度为〇. l-9mM的PVP水溶液;将立方银溶液加至IjPVP水溶液中，立方银溶液与PVP水溶液的 体积比范围可优选为1:20-1:100，在水浴中加热搅拌至沸腾；
[0016] (2)取0.1 mM氯金酸水溶液以0.8-lml/min的速度滴加到上述溶液中，待溶液颜色 由黄色变为接近透明的灰色时，停止滴加氯金酸，加热搅拌回流10~20min后停止反应，得 到金纳米笼。
[0017] 进一步地，将得到的金纳米笼进行离心分离，移除上清液，将所得沉淀加三蒸水进 行超声分散，重复操作3次，将最终产物分散在三蒸水中，得到金纳米笼。
[0018] 本发明具有热疗效应的基因载体的制备方法中，一端带有巯基、另一端接枝聚乙 烯亚胺的阳离子聚合物(C)的制备方法，主要包括以下步骤：
[0019] ⑴将4,4_二硫代二丁酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在冰浴中搅拌2-4h;然后加入N-羟基丁二酰亚胺，再在冰浴中搅拌 2-4h;将聚乙烯亚胺(PEI)溶于DMF，与上述溶液混合，室温下搅拌10h-30h，发生酰胺化反 应，得到白色的不溶于水的似凝胶材料(B);所制备的似凝胶材料(B)悬浮于蒸馏水中，滴加 数滴巯基乙醇，搅拌l_3h，得到初级阳离子聚合物(C);
[0020] 优选的，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)与4,4_二硫代二丁酸的摩尔 比为1:1~4:1，N-羟基丁二酰亚胺与4,4-二硫代二丁酸的摩尔比为1:1~5 :1，聚乙烯亚胺 (PEI)与4,4_二硫代二丁酸的摩尔比为0.03:1~3:1;
[0021] (2)将所得初级阳离子聚合物(C)过滤，滤液在去离子水中透析3_72h，将所得滤液 进行旋蒸，除去大部分水分后，将剩余液体在冷冻干燥机中冻干，得到纯净的巯基化修饰的 阳离子聚合物(C)。
[0022]在阳离子聚合物(C)的制备过程中，采用的聚乙烯亚胺(PEI)的PEI分子结构为带 有支链的分子结构，平均分子量在1000-30000之间。
[0023] 本发明中，将金纳米笼(A)与阳离子聚合物(C)按照一定比例混合对金纳米笼进行 表面修饰，其中，金纳米笼(A)与阳离子聚合物(C)按照摩尔比为1:1~30:1的比例混合，以 使金纳米笼的表面进行硫氢键接枝修饰。
[0024] 在金纳米笼的表面修饰反应过程中，采用超声方法进行表面修饰，反应时间为1-3h，反应体系温度控制在20-50°C之间，超声频率控制在3000-300000HZ之间。
[0025]在表面修饰过程完成后，通过离心收集基因载体（D)，所述的离心转速为50-6000rpm之间，离心时间在5_60min之间。
[0026] 离心后收集的基因载体(D)再应用透析方法清洗掉未反应的阳离子聚合物以及其 他杂质成分，透析次数为1-10次，每次10-30分钟，即可得到纯净的基因载体(D)。
[0027] 本发明的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点:本发明制备的载体具有生 物相容性好、基因转染效率高、细胞毒性低的优点，该载体与质粒DNA形成的复合物细胞毒 性低，同时该载体还具有热效应，可以同时实现热疗和基因治疗的双重效果。
【附图说明】
[0028]图Ι-a和图Ι-b分别为PEI进行巯基化修饰过程中，中间产物DSB的红外谱图和电喷 雾电离(ESI)质谱图。
[0029]图2为基因载体产物的透射电子显微照片。
[0030]图3为基因载体Au-PEI-18000在不同功率的激光照射下其温度与时间的变化曲 线。
[0031]图4为基因载体Au-PEI-18000琼脂糖凝胶电泳凝胶阻滞实验图。
【具体实施方式】
[0032]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是 本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人 员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0033]本发明提供的具有热疗效应的基因载体的制备方法包括以下步骤:首先制备金纳 米笼(A):通过多元醇法制备银纳米立方体，并以此作为模版，制备金纳米笼(A);然后使用 4，4 二硫代二丁酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(英文简称EDC)、N-羟基丁二酰 亚胺和一定分子量的聚乙烯亚胺（英文简称PEI)发生酰胺化反应，得到不溶于水的似凝胶 材料(B)，将似凝胶材料与巯基乙醇反应得到一端带有巯基、另一端接枝聚乙烯亚胺的阳离 子聚合物(C);然后将得到的金纳米笼(A)与这种阳离子聚合物(C)按照一定比例混合对金 纳米笼进行表面修饰，再经过离心和清洗后即得到这种新型的基因载体(D)。
[0034]具有热疗效应的基因载体的制备方法，具体步骤如下：
[0035] 1、金纳米笼的制备：
[0036] 通过多元醇法制备45nm的银立方体，具体方法如下：30ml乙二醇加入到100ml三口 圆底烧瓶中，于155°C油浴中预热搅拌50min，搅拌速率为300rpm。之后，向反应体系以 1000ml/min速率通入氩气。lOmin后，先后注入460μ1 Na〗S · 9H2〇(3mM，乙二醇做溶剂）和 7.5ml聚乙烯吡咯烷酮溶液(20mg/ml，乙二醇做溶剂）。继续搅拌lOmin后，加入2.5mlAgN0 3 溶液(48mg/ml，乙二醇做溶剂），颜色最终变为中心呈绿赭石色、边缘呈红色时，将烧瓶置于 冰水浴中终止反应。待反应液温度冷却至室温后，向体系中加入约等于反应液体积2倍的丙 酮，混合均匀后，溶液颜色由绿赭石色变为巧克力棕色，将溶液离心去除上清液，将沉淀分 散在无水乙醇中，此步操作重复3次以充分除去乙二醇和多余的聚乙烯吡咯烷酮，得到45nm 的银立方体，参考文献（Qiang Zhang，et al.ACS Appl.Mater.Interfaces.2009，l(9): 2044-2048.)〇
[0037]将制备的45nm的银立方体离心处理后分散在三蒸水中，得到银纳米立方体的分散 液，浓度为6_8nM;将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于三蒸水中，配置成浓度为0.卜9mM的PVP水溶 液。
[0038] 滴加5ml 9mM PVP溶液到50ml圆底烧瓶中，放入一个干净的搅拌子。在80~100°C 恒温油浴中加热至沸腾，接着加入1〇〇μ1 8nM银立方体水溶液，搅拌至沸腾状态。用微量注 射器以0.8~lml/min的速率向反应体系中滴加6.5ml 0.1 mM HAuCl4溶液，溶液颜色由黄色 变为接近透明的灰色。注射完毕后，继续回流10~20min直至颜色变得稳定。冷却该系统至 室温。冷却全过程保持磁力搅拌。得到的产物采用3000rpm的转速离心10~30min，移除上清 液，将所得沉淀加 l〇ml三蒸水，超声分散10~30min，然后采用3000rpm的转速离心30min。重 复操作3次。将最终产物分散在三蒸水中，得到金纳米笼。
[0039] 2、阳离子聚合物的巯基化修饰：
[0040] 取6.25mmol4,4-二硫代二丁酸与13.75mmolEDC溶于6.25mlDMF中，在冰浴中搅 拌2h，得到溶液1;取16.25mmol N-羟基丁二酰亚胺溶于5ml DMF，得到溶液2;将溶液2滴加 到溶液1中，冰浴中搅拌2h，得到溶液3;取0.625mmol聚乙烯亚胺PEI-18000(分子量为18000 的PEI)室温下搅拌溶于2.25ml DMF，得到溶液4;取1.5ml溶液3，加入2.25ml DMF，得到的混 合溶液滴加到溶液4中，室温下搅拌过夜，得到白色的不溶于水的中间产物1;将中间产物1 悬浮于12.5ml水中，滴加0.6ml巯基乙醇，搅拌lh，得到反应液5;将反应液5过滤除掉不溶性 杂质，滤液在去离子水中搅拌透析48h，每8h换一次水，除掉小分子杂质。将最终的透析液在 45°C下旋蒸除去大部分水分，将旋蒸瓶中剩余的液体倒入培养皿中，液体高度不超过lcm。 将培养皿置于冷冻干燥机中先进行预冻，待样品温度降至-45°C时，真空冷冻干燥20~30h， 最终得到白色絮状的巯基化修饰的HS-PEI-18000。
[0041] 3、金纳米笼表面接枝阳离子聚合物的制备：
[0042] 金纳米笼与巯基化修饰的HS-PEI-18000按照摩尔比为5:1的比例混合，在功率为 100W的超声机中超声反应lh，反应体系温度为30摄氏度，超声频率为5000Hz，然后以 3000rpm的转速离心30min，移除上清液，将沉淀分散在三蒸水中，重复离心3次，将沉淀分散 在三蒸水中储存备用，得到具有热疗效应的基因载体Au-PEI-18000。
[0043] PEI进行巯基化修饰的合成路线：
[0045] PEI进行巯基化修饰过程中，中间产物DSB的红外谱图和电喷雾电离(ESI)质谱分 别如图Ι-a和图Ι-b所示，红外谱图（图Ι-a)上1680CHT 1处为DSB中C = 0的伸缩振动峰。ESI质 谱（图Ι-b)显示的主产物质荷比为450.1，而DSB理论分子量为432,即DSB带上了质子化的 NH4+，说明成功制备中间产物DSB。
[0046] 对上述制备得到的基因载体Au-PE 1-18000进行如下测试：
[0047] (1)透射电子显微镜测试：
[0048]如图2所示，为用透射电子显微镜表征得到的基因载体产物。从图中可清楚地看 至|J，金纳米笼尺寸均勾、形貌单一，表面被刻蚀成孔洞结构，内部中空，其壁厚约3nm左右，孔 直径15nm左右。
[0049] (2)制备的基因载体Au-PE I -18000的热效应表征：
[0050] 将制备的金纳米笼分别配制成浓度为0.04nM，0.07nM的溶液，在室温为21°C的环 境中，采用波长为800nm的激光器照射分散液，照射时间为300s，并记录分散液温度随激光 照射时间的变化情况。对照组采用二蒸水。
[0051] 结果如图3所示，为同一浓度的金纳米笼溶液在不同功率的激光照射下其温度与 时间的变化曲线，对照组为二蒸水，从上到下三条曲线分别表示:0.07nM、0.04nM金纳米笼 溶液和二蒸水;测试结果显示本发明制备的金纳米笼具有明显的热效应，且随着浓度升高， 升温速率加快。
[0052] (3)制备的基因载体Au-PE I -18000与质粒DNA的结合情况表征：
[0053] 1)制备Au-PE Ι/DNA 复合物
[0054] 按上述实施例制备的Au-PEI-18000与2μ1质粒DNA(EGFP，浓度为375ngAU)按照 Au/DNA质量比为从0到200混合，加1 X TAE缓冲液配成28μ1溶液，在涡旋振荡器上混合lmin， 然后静置30min。
[0055] 2)琼脂糖凝胶电泳实验
[0056] 取28μ1步骤1)中的混合物与2μ1上样缓冲液(6X，Solarbio)充分混合后加入到浓 度为1 %的琼脂糖凝胶中（含IX GelRed Nucleic Acid Gel Stain)，电泳缓冲液为IX TAE， 电压为120V，电泳时间为40min，然后在紫外下观察DNA电泳谱图并拍照。
[0057]如图4所示，为金纳米笼与DNA按照不同质量比复合的凝胶阻滞实验图，其中金纳 米笼表面修饰接枝的是PEI-18000，对照组为裸DNA及PEI-25000;结果显示本发明制备的基 因载体具有很强的DNA结合能力；且当Au/DNA比例大于20时，能观察到明显的阻滞效果，显 示出基因载体Au-PEI-18000具有较好地携带DNA的能力。
[0058]本发明方法以金纳米笼作为母体，表面接枝阳离子聚合物聚乙烯亚胺来构建新型 非病毒基因载体;该载体与质粒DNA形成的复合物具有细胞毒性低，转染效率高等优点，同 时该载体还具有热效应，能同时实现基因治疗和热治疗双重疗效。
【主权项】
1. 一种具有热疗效应的基因载体的制备方法，包括以下步骤： 1) 制备金纳米笼； 2) 采用4,4'_二硫代二丁酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚 胺和聚乙烯亚胺发生酰胺化反应，得到不溶于水的似凝胶材料，将似凝胶材料与巯基乙醇 反应得到一端带有巯基、另一端接枝聚乙烯亚胺的阳离子聚合物； 3) 将得到的金纳米笼与制备的阳离子聚合物混合，对金纳米笼进行表面修饰，再经过 离心和清洗后，即得到具有热疗效应的基因载体。2. 根据权利要求1所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，采用多元 醇法制备金纳米笼，先通过多元醇法制备银纳米立方体，然后以此作为模版，制备金纳米 笼。3. 根据权利要求2所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，所述的金 纳米笼的制备方法包括以下步骤： (1) 通过多元醇法制备银立方体，将制备的银立方体离心处理后分散在三蒸水中，得到 银纳米立方体的分散液，浓度为6_8nM;将聚乙烯吡咯烷酮溶于三蒸水中，配置成浓度为 0. l-9mM的PVP水溶液;将立方银溶液加到PVP水溶液中，在水浴中加热搅拌至沸腾； (2) 取0.1 mM氯金酸水溶液以0.8-lml/min的速度滴加到上述溶液中，待溶液颜色由黄 色变为接近透明的灰色时，停止滴加氯金酸，加热搅拌回流10~20min后停止反应，得到金 纳米笼。4. 根据权利要求1所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，所述的阳 离子聚合物的制备方法包括以下步骤： (1) 将4,4_二硫代二丁酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶于N，N-二甲基甲 酰胺中，在冰浴中搅拌2_4h;然后加入N-羟基丁二酰亚胺，再在冰浴中搅拌2-4h;将聚乙烯 亚胺溶于DMF，与上述溶液混合，室温下搅拌10h-30h，发生酰胺化反应，得到白色的不溶于 水的似凝胶材料;所制备的似凝胶材料悬浮于蒸馏水中，滴加数滴巯基乙醇，搅拌l_3h，得 到初级阳离子聚合物； (2) 将所得初级阳离子聚合物过滤，滤液在去离子水中透析3-72h，将所得滤液进行旋 蒸，除去大部分水分后，将剩余液体在冷冻干燥机中冻干，得到纯净的巯基化修饰的阳离子 聚合物。5. 根据权利要求4所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺与4,4_二硫代二丁酸的摩尔比为1:1~4:1，N-羟基丁 二酰亚胺与4,4_二硫代二丁酸的摩尔比为1:1~5:1，聚乙烯亚胺(PEI)与4,4_二硫代二丁 酸的摩尔比为0.03:1~3:1。6. 根据权利要求5所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，所述的聚 乙烯亚胺的分子结构带有支链，平均分子量为1000-30000。7. 根据权利要求1所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，所述的金 纳米笼与阳离子聚合物的摩尔比为1:1~30:1。8. 根据权利要求1所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，采用超声 方法进行金纳米笼的表面修饰，反应时间为l-3h，反应体系温度为20-50°C，超声频率为 3000-300000HZ。9. 根据权利要求1所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，在表面修 饰完成后，通过离心收集基因载体，所述离心的转速为50_6000rpm，离心时间为5_60min。10. 根据权利要求9所述的具有热疗效应的基因载体的制备方法，其特征在于，离心后 收集的基因载体再采用透析方法进行清洗，透析次数为1-10次，每次10-30分钟，即可得到 纯净的基因载体。
【文档编号】C08G83/00GK105936670SQ201610483719
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】韩璐, 赵玉霞, 董世磊, 李路海, 危岩
【申请人】北京印刷学院