一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法

一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法，属于突变或遗传工程技术领域。以大肠杆菌的“偏好”和“排斥”的密码子分别对人和蟾蜍PPDPF的ORF序列进行密码子优化与合成，分别获得替换后人和蟾蜍的PPDPF重组质粒；转化至大肠杆菌感受态细胞中；挑取单菌落接种于已加入Kan的LB液体培养基中培养形成菌液；菌液按1%接菌于灭菌过的LB培养液中，260rpm于37℃震荡培养至OD600值达到0.7?1，按1/1000的比例加入浓度不同的诱导剂IPTG，诱导两种重组蛋白的表达。将发明应用于原核表达载体及抗血清的指标，具有可实现定点突变等优点。
【专利说明】
一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法，属于突变或遗传工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] PPDPF很可能与多种疾病尤其是恶性肿瘤具有密切联系，在包括胰腺癌、肝癌和肾 癌在内的多种癌症患者体内表达量都有明显升高，因此继续深入研究PPDPF显得很有必要。
[0003] 查阅资料显示，目前还没有有关PPDPF原核表达的研究报道；目前绝大多数重要的 目的基因都是在大肠杆菌中表达的。但原核表达系统也依然存在诸多难以克服的缺点：如 无法调控表达时间和水平、可能毒害宿主细胞、表达产物活性低下、包涵体式表达难以进行 目的蛋白纯化等，因此，如何保持基因片段中仅含有特异性酶切位点也没有公开，如何进行 定点突变以及保证插入载体片段为目的基因，是本申请要解决的技术问题。
[0004] 基于此，做出本申请。

【发明内容】

[0005] 为了克服现有原核表达所存在的上述缺陷，本申请首先提供一种定点突变以保证 插入载体的片段为目的基因的原核表达载体的培养方法。
[0006] 为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：
[0007] -种原核表达载体的培养方法，具体分为如下步骤：
[0008] (1)原核表达载体的构建：以大肠杆菌(E . col i )的"偏好"和"排斥"的密码子分别 对人(11111]^11)和中华大蟾蜍(1311；1^〇83找31^23118)?] ：)0??的01^'序列进行密码子优化，对优化 后的0RF序列进行合成，并连接到表达载体PET-28M + )上，分别获得密码子优化后的人和蟾 蜍的PPDPF重组质粒；
[0009] (2)重组蛋白的诱导表达：
[0010] ①重组子转化：分别将Bufo和人的pET-28b-PPDPF转化至大肠杆菌感受态细胞 BL21中，划线后37°C过夜培养，第二天获得大量单菌落，待大小合适时取出，可暂时放8°C冰 箱保存近期使用。
[0011]②前培养:在诱导重组蛋白表达前一天晚上准备前培养，挑取单菌落接种于2mL已 加入2yL(50mg · mL-OKanamyciWKan)的LB液体培养基中，37°C过夜震荡(220rpm)培养。
[0012] ③大培养:诱导当天将前培养的两种菌液按1 %接菌于高温高压灭菌过的LB培养 液(提前加入Kan至终浓度50yg · ml/1)中，260rpm于37°C震荡培养，约lh时开始用紫外分光 光度计测其0D值，至0D 6QQ值达到0.7-1时，取出一部分菌液作为对照组，其余菌液等分为四 组，按1 /1 〇〇〇的比例加入不同浓度的诱导剂IPTG(0.001，0.01，0.1，lmo 1 · L-1)，将所有菌液 再放回恒温培养箱中37°C260rpm培养l-4h，诱导两种重组蛋白的表达。
[0013] 同时，本申请还提供了一种采用上述载体进行抗血清制备的方法，
[0014]原核表达载体构建是指将目的基因与能够携带外源核酸序列进入原核细胞进行 表达的载体分别进行双酶切后经连接酶将目的基因片段导入载体的过程。此过程中必须保 证目的基因片段中只含有单一的特异性酶切位点，否则需提前进行定点突变以保证插入载 体的片段为目的基因的全长ORF。
[0015] 原核表达系统是指将已插入目的基因 DNA片段的载体（通常为质粒）转化入细菌 (通常为大肠杆菌）后，通过IPTG诱导目的蛋白表达并纯化所需目的蛋白，进而探究目的蛋 白的相关性质及生物学功能。该方法操作简单、表达周期短、蛋白表达量高且成本也比较 低，具有多种优势，因此是目前采用最广泛的一种体外表达方法。但原核表达系统也依然存 在诸多难以克服的缺点：如无法调控表达时间和水平、可能毒害宿主细胞、表达产物活性低 下、包涵体式表达难以进行目的蛋白纯化等。因此，对PPDPF构建真核表达载体，并试图在细 胞水平上研究其作用机制显得很有必要。
[0016] 本发明通过对中华大蟾蜍PPDPF和人PPDPF 0RF部分密码子优化，然后合成并成功 构建中华大蟾蜍pET-28b-PPDPF和人pET-28b-ProPF原核表达载体，并在大肠杆菌感受态细 胞BL21中成功表达，经探究发现两种重组蛋白在37°C下的最佳诱导条件为：IPTG浓度为 O.lmmol · L-1诱导时间为AhJestern botting检测结果显示仅该过量表达的条带能被抗 His-tag抗体识别，表明该蛋白即为目的蛋白PPDPF。
[0017] 本申请利用大肠杆菌作为PPDPF蛋白的原核表达细胞，进行该重组蛋白的体外表 达，为后续进一步进行重组蛋白的大量表达纯化及鼠抗PPDPF抗血清的制备奠定实验基础。 采用的原核表达系统技术的主要流程是将前期克隆到的目的基因的0RF进行密码子优化并 合成，然后连入表达载体形成重组质粒，再通过转化将其导入某原核细胞内进行复制和扩 增，当达到对数生长期时加入诱导剂使目的蛋白得到表达，该方法具有研究深入、培养条件 简单、基因操作容易、从构建到产物纯化周期短、成本低、产量高、易于规模化等诸多优点。
【附图说明】
[0018] 图1为表达载体pET-28b( + )的图谱；
[0019] 图2为中华大蟾蜍PPDPF的诱导表达；
[0020] 图3为人PPDPF的诱导表达；
[0021] 图2和图3中，M:标准蛋白；1:未诱导样品；2-4,5-7,8-10，11-13分别为1?16浓度为 0.001、0.01、0· 1、lmmol · 1/^2,3,4:诱导2、3、4h时的样品；5-7,8-10,11-13同2-4;
[0022] 图4为中华大蟾蜍PPDPF和人PPDPF重组蛋白可溶性检测；
[0023]其中，M:标准蛋白；1，5:未加 IPTG样品；2，6:诱导后全菌；3，7:诱导菌体裂解后上 清;4,8:诱导菌体裂解后沉淀；
[0024] 图5为中华大蟾蜍PPDPF重组蛋白的Western blotting检测；
[0025] 图6为人的PPDPF重组蛋白的Western blotting检测；
[0026] 图5和图6中，Μ:标准蛋白；1，2:考马斯亮蓝染色的样品；3,4:Western blotting样 品；1，3:未用IPTG诱导的样品；2，4: IPTG诱导4h的样品；
[0027]图7为中华大蟾蜍PPDPF重组蛋白纯化结果；
[0028]图8为人PPDPF重组蛋白纯化结果；
[0029]图7和图8中，M:标准蛋白；1:最后一次穿流液;2-6:5次洗涤液样品；7-11:5次洗脱 液纯化的样品；12:菌体裂解后上清;13:菌体裂解后包涵体沉淀；
[0030] 图9为中华大蟾蜍PPDPF及人PPDPF重组蛋白切胶纯化结果；
[0031]图9中，Μ:标准蛋白；1，6:未诱导样品；2，7: IPTG诱导全菌样品；3，8:诱导菌体裂解 后上清;4，9:诱导菌体裂解后包涵体沉淀;5，10:对初步纯化蛋白进行切胶纯化样品；
[0032]图10为鼠抗中华大蟾蜍PPDPF抗血清特异性检测；
[0033]图11为鼠抗人PPDPF抗血清特异性检测；
[0034] 图10和图11中，M:标准蛋白；1-5:考马斯亮蓝染色样品；6_10:western blotting 样品；1，6:未诱导样品；2,7:IPTG诱导全菌样品；3,8:诱导菌体裂解后上清;4,9:诱导菌体 裂解后包涵体沉淀;5，10:切胶纯化后的重组PPTOF。
【具体实施方式】
[0035] 1实验材料与试剂
[0036] 1.1主要实验仪器
[0037] Bio-Rad电泳仪、蛋白质垂直电泳槽购自上海伯乐生命医学产品有限公司；转移电 泳槽购自上海天能科技有限公司；紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司。
[0038] 1.2主要材料试剂
[0039] 实验试剂:ECL发光试剂盒购自北京博奥龙免疫技术有限公司。
[0040] 1.3主要溶液配制
[00411 1.3.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相关溶液的配制
[0042] (1)30%聚丙稀酰胺(30%厶厶）：称丙稀酰胺(厶(：巧1311^(16)298及1'1，1'|-亚甲基丙稀酞 胺lg加入约80mL ddH20中，搅拌至充分溶解，移至量筒，再加去离子水(ddH20)定容至100mL， 4 °C避光保存备用。
[0043] (2)10%过硫酸铵(APS):称0.2g过硫酸铵溶于2mL ddH20中，-20°C保存。
[0044] (3)1.5mol · L-^ris-HCKpHS.S):称Tris 181.7g溶于约800mL ddH20中，滴加 5mol · Γ1盐酸调pH值至8.8后，加去离子水定容至100〇11^，室温保存。
[0045] (4)1.〇111〇1.1/11^8-!1(：1(口!16.84!17.6) :称1^8 121.18溶于约80〇11^(1(1!12〇中， 滴加5mol · L-1盐酸调pH值至6.8(或7.6)，加((1(1!120)定容至10001^，室温保存。
[0046] (5)15%SDS聚丙烯酰胺（分离胶，10mL):向小烧杯中依次加30%丙烯酰胺 (Acrylamide)溶液5mL(开始揽摔），ddH2〇 2.3mL，1.5mol · SDS 0.1mL，10%APS 0.1 mL，TEMED (h004mL，搅拌均匀后立即灌胶。
[0047] (6 5%SDS聚丙烯酰胺（浓缩胶，4mL):向小烧杯中依次加30%丙烯酞胺溶液 0.67mL(开始搅拌），ddH20 2.7mL，lmol · L-^risCpHe.SW.SmUlO^SDSO.iMmLaO^APS 0.04mL，TEMED 0.004mL，搅拌均匀后立即灌胶。
[0048] (7)5XSDS蛋白质电泳上样缓冲液:加 lmol · L-^TrisbHe.SHJSmL于10mL塑料离 心管中，称溴酚蓝〇. 〇25g、SDS 0.5g加入充分溶解，再加入甘油2.5mL，最后加 ddH20定容至 5mL(500yL/份分装，使用前每份加入25μ?3-巯基乙醇）。
[0049] (8)5XTris-甘氨酸电泳（SDS-PAGE)缓冲液:称 Tris 碱 15.1g，甘氨酸(Glycine) 94g，SDS 5.0g加约600mL ddH20充分溶解后，加入去离子水定容至1000mL，室温保存。
[0050] (9)考马斯亮蓝染色液的配制:称0.25g考马斯亮蓝(Commassise blue，R250)溶于 90ml甲醇和水(1:1)的混合液，再加入10mL冰醋酸，过滤除去颗粒物质后常温保存。
[0051] 1 ·3.2免疫印迹(Western blotting)相关溶液的配制
[0052] (1)膜转移缓冲液:称甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g加入约600mL ddH20中充 分搅拌溶解后，加 ddH20定容至800mL，再加入200mL的甲醇轻轻颠倒混匀，室温保存。
[0053] (2)TBST缓冲液：称NaCl 8.8g于800mL ddH20中溶解，加入l.Omol · L-^ris-HCl (pH7.6)20mL，再加入0.5mL Tween 20充分搅拌混匀后，用ddH20定容至1L，4°C保存备用。
[0054] (3)封闭缓冲液:脱脂奶粉5g加入到1 OOmL的TBST缓冲液中，充分搅拌溶解，4°C保 存备用。
[0055] 2实验方法
[0056] 2.1原核表达载体的构建
[0057]因采用传统方法构建的原核表达载体连接PPDPF之后并不能在所选的原核表达宿 主菌株E. col i中顺利表达，本实验室试图针对E. col i "偏好"和"排斥"的密码子对蟾蜍 PTOPF的0RF序列进行优化(保证优化前后其所编码的氨基酸序列完全一致），降低E. coli对 PH)PF的排斥程度，使该基因编码的蛋白能顺利通过E. col i表达;为今后进一步研究PPDPF 与人的关系，从NCBI数据库下载了人(Human) PPDPF的0RF序列，并用同样的方法对人PPDPF 的0RF进行了密码子优化。
[0058]密码子优化后的0RF序列委托苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，并连接到 表达载体PET-28M + )上，分别获得替换后Bufo和Human的PPDPF重组质粒pET-28b-PPDPF-Bufo和pET-28b-PPDPF-Human。
[0059] 2.2重组蛋白的诱导表达
[0060] 2.2.1重组子转化
[0061 ] 分别将Bufo和Human的pET-28b-ProPF转化至E.coli感受态细胞BL21中，划线后37 °(：过夜培养，第二天获得大量单菌落，待大小合适时取出，可暂时放8°C冰箱保存近期使用。
[0062] 2.2.2前培养
[0063]在诱导重组蛋白表达前一天晚上准备前培养，挑取单菌落接种于2mL已加入2yL (50mg · mL-1 )Kanamycin的LB液体培养基中，37°C过夜震荡(220rpm)培养。2.2.3大培养 [0064]诱导当天将前培养的两种菌液按1%接菌于高温高压灭菌过的LB培养液(提前加 入Kan至终浓度50yg · ml/1)中，260rpm于37°C震荡培养，约lh时开始用紫外分光光度计测其 0D值，至OD600达到0.7-1时，取出一部分菌液作为对照组，其余菌液等分为四组，按1/1000的 比例加入不同浓度的诱导剂IPTG(0.001，0.01，0.1，lmo 1 · I/1)，将所有菌液再放回恒温培 养箱中37°C260rpm培养l-4h，诱导两种重组蛋白的表达。
[0065] 在培养时间为2、3、4h时分别取各样品lmL进行离心，13 200rpm离心lmin，彻底去 上清后，将菌体溶于100yL的蛋白质上样缓冲液中，连同Protein Marker-起于干燥恒温器 中100°C处理5min，取出后迅速置于冰上冷却，最后将所有样品分别取5yL进行SDS-PAGE电 泳，检测中华大蟾蜍PPDPF和人PPDPF两种重组蛋白的诱导表达情况。
[0066] 2.2.4SDS-PAGE 电泳
[0067] 1 · SDS-PAGE 电泳胶制作：
[0068] (1)将厚薄两块玻璃板重叠下端对齐，确保玻璃板之间有灌胶缝隙，在制胶夹上固 定后整体装到制胶架上固定(垫有橡胶条）。
[0069] (2)根据15%分离胶的配方（目的蛋白分子量较小，选用高浓度的胶进行电泳)分 别将各成分加到小烧杯中（注:使用PH8.8浓度1.5mol · I/1的Tris-HCl)，在最后加入10% APS和TEMED后，确保用磁力搅拌器上充分混匀。
[0070] (3)迅速将胶倒入两个玻璃板间，高度控制为玻璃板的2/3左右，剩余部分用ddH20 填满，室温静置。当分离胶凝聚后(H 2〇和胶之间会出现一条明显的分割线），尽可能倒尽两 板之间的ddH2〇。
[0071] (4)根据浓缩胶的配方分别将各成分加入到小烧杯中（注：使用pH6.8浓度 l.Omol · Γ1的Tris-HCl)，同样在加完10%APS和TEMED后充分混匀，迅速倒入两玻璃间至满 为止。
[0072] (5)插入孔数和大小合适的梳子，室温静置待浓缩胶充分凝聚。
[0073] 2. SDS-PAGE电泳检测两种蛋白的表达
[0074] (1)小心地垂直拔出SDS-PAGE梳子，用ddH20清洗胶孔，确保上样孔无过多泡沫或 任何其他异物，将玻璃板装到电泳架上，用ddH20检漏。
[0075] (2)向电泳架之间加入1 X SDS-PAGE电泳液至加满为止，取5yL处理好的样品（100 °C煮沸5min)分别上样，将上好样的电泳架小心移至电泳槽中，向电泳槽补充电泳液至约2/ 3。采用恒流电泳，以每块胶为10mA标准设置电流大小，样品进入分离胶后电流可加倍。
[0076] (3)电泳结束后，按顺序取出胶，简单冲洗后切除浓缩胶(为避免多块胶混淆，可适 当切角以示区别），将分离胶放到染色皿中用ddH 20清洗2-3次，每次5min。洗净后加入事先 配置好的考马斯亮蓝染色液，微波炉加热至微烫，轻轻振荡染色〇. 5h.
[0077] (4)回收染色液(可重复利用），简单冲洗后加自来水于微波炉加热至微烫，轻轻振 荡脱色20min，之后换水两到三次并重复上述步骤直至背景颜色基本透明，观察重组蛋白表 达情况，并对必要数据进行保存并备份。
[0078] 2.2.5重组蛋白的可溶性检测
[0079]经上述实验，发现两种蛋白在E.coli均能够顺利表达，且在诱导剂IPTG工作浓度 为O.lmmol · I/1，诱导时间为4h时表达量最高，因此继续对的该蛋白进行性质的进一步检测 很有必要。
[0080] (1)分别取lmL经IPTG(终浓度1謹〇1 · L-4诱导3h的菌液加入已知重量的1.5ml离 心管，13 200rpm离心lmin，去上清，再次称量离心管重量，得出菌体重量。
[0081 ] (2)按lyg菌体对应20yL比例加入X-tractor裂解液，充分悬浮菌体。加入DNasel约 0. lyL避免溶液出现粘稠，另加入一定量溶菌酶(终浓度为lmg · ml/1)，室温放置10min，每 2min上下颠倒一次。4°C13 200rpm离心20min。
[0082] (3)取上清到另一个离心管中（作为上清样品保留检测用），再在离心管中加入与 X-Tractor等量的ddH2〇，将沉淀充分悬浮。
[0083] (4)取上清和沉淀悬浮液各10yL，加入2.5yL的5XSDS上样缓冲液，100°C处理5min 后迅速置于冰上。
[0084] (5)取5yL处理过的的样品进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白水溶性。
[0085] 2.2.6免疫印迹(Western blotting)检测
[0086] (l)SDS-PAGE电泳:在同一块胶左右，加两组相同的样品，左边用于考马斯亮蓝染 色(考染），右边用于转膜，用于转膜的样品上样量可为考染的1/5。
[0087] (2)转膜:SDS-PAGE电泳结束后切胶，按胶块大小剪下形状完大小完全相同的PVDF 膜和稍大的滤纸(每块胶用量6片），PVDF膜用甲醇浸泡5-10min后将海棉、PVDF膜、胶和滤纸 一起放入转印缓冲液中浸泡15min。按照从负极到正极（即由黑-红）依次放置海棉-滤纸3 层-胶-PVDF膜-滤纸3层-海棉的顺序组装"三明治"夹板，并确保胶和膜之间接合紧密无任 何气泡（否则会严重影响转印效果），组装好后放入转印槽中加满转印缓冲液，恒压条件用 65V转印约2.5h，转膜时间根据蛋白的大小而定，蛋白分子量越大所需转印时间越长。
[0088] (3)封闭：转印结束后，ddH20水洗PVDF膜2-3次，每次5min。洗好后在封闭液（5g脱 脂乳溶于l〇〇mL TBST溶液）中处理1-2h(可放置室温缓慢震摇），再用TBST轻摇洗涤2次，每 次5min〇
[0089] (4)一抗处理：TBST溶液或一抗稀释液稀释His-tag抗体2 000倍，将上述洗好的 PVDF膜放入其中，4°C过夜轻摇。
[0090] (5)二抗处理:将PVDF膜从一抗中取出用TBST轻摇洗涤3次，每次5min，加入用TBST 稀释2 000倍的二抗(HRP标记的羊抗小鼠抗体)溶液中，室温轻摇振荡处理lh，TBST轻摇洗 涤5次，每次5min(必须彻底清洗干净）。
[0091] (6)显色:按照ECL发光试剂盒说明，将I液和Π 液事先分别稀释6倍后等体积混合， 将PVDF膜置于干净的保鲜膜上，用移液枪吸取混合均匀覆盖于PVDF膜上。
[0092] (7)胶片曝光:待荧光出现，去尽显色液，用保鲜膜将PVDF膜包好后放入暗盒中，压 上合适大小的X光胶片，根据荧光亮度确定曝光时间，越亮曝光时间越短，时间从数秒至数 分钟不等。曝光完成后，将胶片放入显影液(确保显影液为粉红色，棕色即为氧化，若冬天结 冰需提前温浴）中，待清晰条带出现后放入定影液中定影2-3min。胶片洗涤晾干后，进行扫 描和图像剪辑。
[0093] 3实验结果
[0094] 3.1原核表达载体的构建
[0095] 对中华大蟾蜍PPDPF和人PPDPF 0RF的密码子进行优化后，成功构建了两个重组质 粒 pET-28 (b+) -PPDPF-Bufo 及 pET-28 (b+) -PPDPF-Human。
[0096] 3.2SDS-PAGE检测重组蛋白PPDPF的诱导表达情况
[0097] 将两种重组质粒转化至E.coli感受态细胞BL21后，分别用浓度为1，0.1，0.01， O.OOlmol · L-1的IPTG以1/1000比例加入后诱导转化，结果发现加入IPTG的重组质粒的菌相 比未加 IPTG诱导的菌多出1条明显的蛋白条带，而且分子量与预测的接近，说明成功表达了 两种携带His标签的蟾蜍和人的PPDPF重组蛋白，前者较后者表达量偏高。
[0098] 结果分析还发现，在不同浓度的的IPTG诱导下，工作浓度为lmmol · I/1和 0. lmmol ·厂1的时候两种蛋白有表达，更低浓度的诱导表达效果不明显，而时间上则是在诱 导4小时的时候蛋白表达效果最佳(参见图2和图3所不）
[0099] 3.3重组蛋白可溶性检测
[0100] 选用两个0. lmol · L-hPTG诱导4h的菌体样品进行处理，经Xtractor裂解液、DNase I和溶菌酶处理l〇min后，SDS-PAGE电泳检查该重组蛋白可溶性，结果显示该重组蛋白在上 清和沉淀中均有出现，但上清中较沉淀中多（如图4所示）。说明该蛋白偏水溶性(取不同诱 导时间样品进行检测结果类似）
[0101] 3.4重组蛋白免疫印迹
[01 02]为进一步确定该重组蛋白是否为目的蛋白PPDPF，使用小鼠抗Hi s- tag抗体进行 Western blotting检测，结果显示，诱导前的样品在分子质量17kD处无特异性条带出现，只 有用IPTG诱导4h的样品在约17kD处的蛋白条带能够被Hi s抗体识别，与蟾蜍和人的PPDPF重 组蛋白的预期分子量吻合，表明该蛋白确实是目的重组蛋白。
[0103] 4结论与讨论
[0104]原核表达载体构建是指将目的基因与能够携带外源核酸序列进入原核细胞进行 表达的载体分别进行双酶切后经连接酶将目的基因片段导入载体的过程。此过程中必须保 证目的基因片段中只含有单一的特异性酶切位点，否则需提前进行定点突变以保证插入载 体的片段为目的基因的全长0RF。
[0105] 原核表达系统是指将已插入目的基因 DNA片段的载体（通常为质粒）转化入细菌 (通常为大肠杆菌）后，通过IPTG诱导目的蛋白表达并纯化所需目的蛋白，进而探究目的蛋 白的相关性质及生物学功能。该方法操作简单、表达周期短、蛋白表达量高且成本也比较 低，具有多种优势，因此是目前采用最广泛的一种体外表达方法。但原核表达系统也依然存 在诸多难以克服的缺点：如无法调控表达时间和水平、可能毒害宿主细胞、表达产物活性低 下、包涵体式表达难以进行目的蛋白纯化等。因此，对PPDPF构建真核表达载体，并试图在细 胞水平上研究其作用机制显得很有必要。
[0106] 本发明通过对中华大蟾蜍PPDPF和人PPDPF 0RF密码子优化和基因合成，成功构建 中华大蟾蜍pET-28b-PPDPF和人pET-28b-PPDPF原核表达载体，并在大肠杆菌感受态细胞 BL21中成功表达，经探究发现两种重组蛋白在37°C下的最佳诱导条件为：IPTG浓度为 O.lmmol · L-1诱导时间为4h(见图2和图3) Western blotting检测结果显示仅该过量表达 的条带能被His-tag识别，表明该蛋白即为目的蛋白PPDPF(见图5和图6)。
[0107]抗血清是将某种目的蛋白进行纯化去除其他杂蛋白后选择合适的动物体
[0108] (羊、马、鸡、猴、豚鼠）进行多次注射免疫，使动物体产生抗体并进行血液采集获得 抗目的蛋白的抗血清。抗血清是一种含有多克隆抗体的血清，不仅有助于进一步的科学研 究工作，还可通过注射抗血清可以传递被动免疫(passive immunity)预防、诊断和治疗许 多疾病。如抗血清可作为标准阳性血清用于研究；目前唯一能够治疗埃博拉病毒患者的方 法就是通过注射前一个患者的抗血清到患者体内。
[0109] 本研究室前期工作中成功构建中华大蟾蜍PPDPF和人PPDPF的原核表达载体，且成 功表达并掌握了最佳表达条件。为进一步研究该蛋白的生物学特性，预对其进行重组蛋白 的大量表达、纯化和小鼠抗该重组蛋白抗血清的制备
[0110] 5实验材料与试剂
[0111] 5.1主要实验仪器
[0112] 紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司，TAL〇N?2-mL Disposable Gravity Column购自大连宝生物工程有限公司。其余所需设备同1.1。
[0113] 5.2主要材料试剂
[0114] 实验动物及材料:小白鼠和鼠饲料购于浙江省实验动物中心，5-6周龄健康的雌鼠 和雄鼠各4只分开饲养。
[0115] 试剂：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购于Sigma公司。BeyoGold? His-tag Purification Resin购自碧云天生物技术有限公司。其余试剂与1.2相同。
[0116] 5.3主要溶液配制
[0117] (1)20%脱氧胆酸钠(DOC):称2g脱氧胆酸钠粉末溶于lOmL ddH20，室温保存，使用 前稀释10倍。
[0118] (2)10mg · mL-1溶菌酶:称溶菌酶粉末10mg溶于lmL ddH20，-20°C保存备用。
[0119] (3)非变性裂解液:称NaH2P〇4 6.9g，NaCl 17.54g，溶解于800mLddH20中，NaOH调节 pH至8.0，加 ddH20定容至1000mL，室温保存。
[0120] (4)非变性洗涤液（2mmol · L-1 咪唑）：称NaH2P〇4 6.9g，NaCl 17.54g，咪唑 (imidazole)0· 136g溶解于800mL ddH2〇中，NaOH调节pH至8·0，加 ddH2〇定容至1000mL，室温 保存。
[0121] (5)非变性洗脱液（300mmol · L-1 咪唑）：称NaH2P〇4 6.9g，NaCl 17.54g，咪唑 (imidazole )20 · 4g溶解于800mL去离子水中，NaOH调节pH至8 · 0，加 ddH2〇定容至1000mL，室 温保存。
[0122] (6)0.9%NaCl:称0.9gNaCl溶解于 100mL ddH20中，常温保存。
[0123] 6实验方法
[0124] 6.1上清重组蛋白PPDPF的纯化
[0125] 经3.3可溶性检测，该蛋白在上清和沉淀中均出现，鉴于上清中表达量较多，先采 用上清纯化Bufo和人PPDPF重组蛋白。
[0126] (1)将阳性克隆扩大培养得400mL菌液，50mL离心管称重后进行菌液离心，5000rpm 10min，最后称量收集的菌体。
[0127] (2)按lg菌体加入2-5mL裂解液加入X-tractor，彻底悬浮菌体后转入10mL离心管， 超声仪(额定功率450W)调至50%左右即200-300W，进行冰上超声约15-20min直至悬浮液透 亮为止，确保探头末端不接触离心管管底或管壁，工作和间歇时间均为3s(若溶液太粘稠可 适量加入RNaselOyg · mL-1，DNase5yg · πιΤΓ1) 〇
[0128] (3)4°C 13 200rpm离心15min。收集上清用来纯化，沉淀则用2%脱氧胆酸钠洗涤一 次离心，再用超纯水洗涤一次，-20°C保存。
[0?29 ] (4)按每毫升的固体凝胶可结合大约3mg蛋白量加入50 %的凝胶(BeyoGo 1 d? Hi s- tag Purification Resin，凝胶固体与储存液比例为1:1)，4°C13200rpm离心30s，弃去储存 液，加入1倍体积的非变性裂解液平衡，4°C 13 200rpm离心30s，重复1-2次，将凝胶放入纯化 柱。
[0130] (5)将超声裂解后的上清液灌柱，反复3-5次，以充分结合带His标签的两种重组蛋 白，收集最后一次穿流液并从中取出4yL进行电泳检测。
[0131] (6)2倍柱体积的非变性洗涤液洗柱5次，每次取4yL样品用于后续检测。
[0132] (7) 1倍柱体积的非变性洗脱液洗脱6-10次，分别取0.5yL用于SDS-PAGE检测，已确 定浓度及纯度。
[0133] 6.2切胶法纯化重组蛋白PPDPF
[0134] 鉴于上清纯化结果一直有较多杂带，裂解后的沉淀包涵体中也有较多杂带，发明 人尝试同时针对已纯化后的上清蛋白及沉淀包涵体进行切胶纯化，为后续抗血清的制备做 准备。
[0135] (1)将两种纯化后的蛋白收集液及沉淀包涵体分别进行的SDS-PAGE(依旧用15% 的分离胶）。
[0136] (2)电泳结束后取下胶直接进行预冷的0.25mol · L-1的KC1溶液染色10-20min，待 出现明显的乳白色的较粗条带立即切下，切下的胶条换用超纯水震荡洗涤5min，换水重复 1-2次，去除KC1。
[0137] (3)收集同一种蛋白的胶条混到一起，纸巾吸尽表面水分后用两层保鲜膜包好，用 切胶片尖端水平碾压直至变成粉末状。
[0138] (4)将胶末转移至2mL离心管，加入约等体积的0.9%NaCl，用2mL注射器针头多次 抽吸，使胶块更为细小便于免疫。
[0139] (5)依据上样比例估算重组蛋白（固定于PAGE胶中）的浓度。
[0140] 6.3鼠抗中华大蟾蜍PPDPF和人PPDPF抗血清的制备
[0141] (1)随机选取6-8周龄的小鼠共8只分为3组，第一组两只作为空白组，第二组和第 三组均为三只，分别注射中华大蟾蜍PPDPF重组蛋白和人PPDPF重组蛋白，免疫前鼠笼上做 好标记。
[0142] (2)按每只小鼠约20yg的剂量稀释好50%的蛋白胶液，首次免疫加入等体积的弗 氏完全佐剂充分乳化，使蛋白被弗氏完全佐剂完全包裹为止，小鼠采用背部皮下多点注射 免疫。
[0143] (3)第一次免疫结束20天后进行第二次免疫，改用加入相同体积的弗氏不完全佐 剂乳化并进行免疫，之后每隔一周按第二次的方法重复免疫一次，共免疫四次。
[0144] (4)第四次免疫后过一周心脏采血，将采集的血液37°C放置lh后4°C过夜放置或直 接4°C离心15min。
[0145] 6.4Western blotting检测两种抗血清特异性
[0146] 分别用制备的鼠抗蟾蜍PPDPF(3号雄鼠）和鼠抗人PPDPF抗血清（3号雌鼠）作为一 抗，用一抗稀释液或TBST溶液稀释5000倍后，按照.2.2.的方法进行Western blotting，检 测抗血清的特异性。
[0147] 7实验结果
[0148] 7.1中华大蟾蜍PPDPF及人PPDPF重组蛋白的纯化
[0149] 7 · 1 · 1上清及包涵体中纯化PPDPF
[0150] 经BeyoGold? His-tag Purification Resin凝胶纯化得到的两种重组蛋白，经 SDS-PAGE检测纯化效果，结果显示，所提取的蛋白浓度较高，但纯度还达不到抗血清制备要 求，经超声裂解后的沉淀包涵体也含有较多杂带（图7、8)，经多次重复实验结果相似。
[0151] 7 · 1 · 2切胶法纯化 PPDPF
[0152] 首次纯化后的中华大蟾蜍PPDPF及人PPDPF重组蛋白经过大量样品
[0153] SDS-PAGE后，用0.25M · L-1的KC1染色后切下白色目的条带，彻底碾碎后用针头反 复抽吸使胶末更为细小便于免疫，经进一步切胶纯化获得了纯度较高的可以满足制备抗血 清需要的两种重组蛋白（图9)。
[0154] 7.2Western blotting检测抗血清结果
[0155] 经免疫获得鼠抗中华大蟾蜍重组PPDPF和鼠抗人重组PPDPF抗血清。以制备的两种 抗血清分别作为一抗，Western blotting检测抗体与抗原的特异反应性，结果证明所制备 抗血清具有很好的特异性，也说明该两种重组蛋白具有较好的免疫原性(图1〇、11)。
[0156] 8结论与讨论
[0157] 通过大量培养顺利表达中华大蟾蜍和人的重组PPDPF，同时纯化上清和包涵体中 的重组蛋白，对纯化后的蛋白进行切胶回收进一步纯化，并免疫小鼠制备抗血清。两种抗血 清经Western blotting检测均具有良好的抗原识别特异性，中华大蟾蜍抗血清组中上清和 沉淀样品检测结果不佳，推测可能与转膜效率或曝光时间有关。
[0158] 抗血清在科学研究和实际应用中均具有相当重要的作用，如在研究中可用作标准 阳性血清，又或者是在临床应用中作为一种治疗性抗体。总之，两种抗血清的成功制备为今 后进一步探究PPDPF的生物学功能奠定了理论基础，鼠抗人重组PPDPF抗血清的制备更让 PH)PF应用于人类成为可能。
[0159] 以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详 细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演 或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。
【主权项】
1. 一种原核表达载体的培养方法，其特征在于： (1) 原核表达载体的构建：以大肠杆菌的"偏好"和"排斥"的密码子分别对人和蟾蜍 PTOPF的ORF序列进行密码子优化和合成，并连接到表达载体pET-28b ( + )上，分别获得密码 子优化后人和蟾蜍的P/OTF重组质粒，蟾蜍和人的重组重组蛋白分子量分别为17.26kD和 17.14kD； (2) 重组蛋白的诱导表达:将步骤（1)的Ρ/?Ψ重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中， 37°C过夜培养获得大量单菌落;挑取单菌落接种于2mL已加入2yLKanamycin的LB液体培养 基中，37°C过夜震荡220rpm培养形成菌液;菌液按1%接菌于灭菌过加入Kan至终浓度50yg · ml/1的LB培养液中，260rpm于37°C震荡培养至OD值达到0.7-1，取出一部分菌液作为对照 组，其余菌液等分为四组，按1 /1 〇〇〇的比例加入浓度不同的诱导剂IPTG，将所有菌液再放回 恒温培养箱中37 °C 260rpm培养l-4h，诱导两种重组蛋白的表达。2. 如权利要求1所述的一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法，其特征在于： 步骤(2)中，所述的单菌落预先培养时，培养出的单菌落要置于8°C环境下备用。3. 如权利要求1所述的一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法，其特征在于： 所述的诱导剂IPTG的添加浓度分别为0.001 mol.L'O.Ol mol.L'0.1 mol.L'lmol.L-、4. 如权利要求1所述的一种原核表达载体的培养及其抗血清的制备方法，其特征在于： 步骤(2)中，所述的重组蛋白在37°C下的最佳诱导条件为：IPTG浓度为0.1 mmol · IZ1诱导时间 为4h。5. 如权利要求1-4任一项所述方法培养的原核表达载体进行抗血清的制备方法，其特 征在于： (1) 取上清液进行纯化:采用阳性克隆扩大培养得菌液，称重后进行菌体离心，5000rpm lOmin，最后收集到的菌体称重；按Ig菌体加入2-5mL裂解液加入X-tractor，彻底悬浮菌体 后，超声调至200-300W进行冰上超声15-20min，至悬浮液透亮，工作和间歇时间均为3s;4°C 13 200rpm离心15min，收集上清用来纯化，沉淀则用2%脱氧胆酸钠洗涤一次离心，再用超纯 水洗涤一次，-20°C保存；按每毫升的固体凝胶可结合3mg蛋白量加入50%的凝胶，4°C 13200rpm离心30s，弃去储存液，加入1倍体积的非变性裂解液平衡，4°C 13200rpm离心30s， 重复1-2次，凝胶上蛋白纯化柱;凝胶上柱后，用超声裂解后的上清液灌柱，收集穿流液3-5 次，以充分结合带His标签的两种重组重组蛋白，收集最后一次穿流液并从中取出4yL进行 跑胶检测;2倍柱体积的非变性洗涤液洗柱5次，每次取4yL样品用于后续检测；1倍柱体积的 非变性洗脱液洗脱6-10次，每次用1个EP管分装，分别取出0.5yL用于跑SDS-PAGE电泳检测 浓度及纯度； (2) 切胶法纯化重组蛋白PPDPF:对步骤（1)两种纯化后的蛋白收集液及沉淀包涵体分 别进行大量样品的SDS-PAGE电泳;跑胶结束后取下胶直接进行预冷的0.25M· IZ1的KCl溶液 染色10-20min，待出现明显的乳白色的较粗条带立即切下，切下的胶条换用超纯水震荡洗 涤5min，换水重复1-2次，去除KCl;收集同一种蛋白的胶条混到一起，吸尽表面水分后用保 鲜膜包好，用切胶片尖端水平碾压直至变成粉末状;将胶末转移至2mL离心管，加入等体积 的0.9%NaCl，多次抽吸，使胶块更为细小便于免疫;取纯化好的蛋白进行比例上样估计胶中 的蛋白浓度； (3) 抗血清制备：随机选取6-8周龄的小鼠共8只分为3组，第一组两只作为空白组，第二 组注射中华大蟾蜍PPDPF重组蛋白，第三组注入人PPDPF重组蛋白；按每只小鼠20yg的剂量 稀释好50%的蛋白胶液，首次免疫加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，使蛋白被弗氏完全 佐剂完全包裹为止，小鼠采用背部皮下多点注射免疫;第一次免疫结束20天后进行第二次 免疫，改用加入相同体积的弗氏不完全佐剂乳化进行免疫，之后每隔一周按第二次的方法 重复免疫一次，共免疫四次;第四次免疫后过一周心脏采血，将采集的血液37°C放置Ih后4 °C过夜放置或直接4 °C离心15min。
【文档编号】C12R1/19GK105950629SQ201610401830
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】李玉兰, 何军邀, 杨仙玉, 岳继萍
【申请人】浙江医药高等专科学校