一种全面下调棉花番茄红素环化酶基因的表达载体及应用

一种全面下调棉花番茄红素环化酶基因的表达载体及应用
【专利摘要】本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种全面下调棉花番茄红素环化酶(Lyc)基因的表达载体及其应用。本发明的技术方案是分别从5对棉花Lyc基因中选取一段编码序列串联构建RNAi元件，通过转基因方法在棉花中转录该元件，最终达到同时下调5对Lyc基因和调控棉花体内类胡萝卜素合成的目的。本发明的RNAi元件及载体可用于调控棉花类胡萝卜素含量和种类。
【专利说明】
一种全面下调棉花番茄红素环化酶基因的表达载体及应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种能全面下调棉花番茄红素环化 酶基因，调节棉花类胡萝卜素合成的表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 类胡萝卜素是普遍存在于植物、动物和微生物中的一类含40个碳原子骨架的萜类 物质。由于含有共辄双键，类胡萝卜素一般呈现黄色和红色，是植物重要的光合色素和光保 护剂，同时也是植物果实、花等的主要成色因子。前人研究表明，利用基因工程技术在植物 中调控类胡萝卜素合成酶基因的表达，可以改变类胡萝卜素途径的流向，有目的地改变植物 体内类胡萝卜素的最终含量和成分，进而达到改良作物色彩和营养品质的目的。如在水稻胚 乳、油菜种子和马铃薯块茎中上调类胡萝卜素合成酶基因，成功提高了这些农产品的胡萝 卜素水平和营养品质棉花是世界上需求量最大的天然纤维作物，同时也是重要的油料作 物。利用基因工程技术改变棉花组织(如种子和纤维）中的类胡萝卜素合成，是棉花纤维色彩 和棉籽营养品质改良重要手段，具有广阔的应用前景。
[0003]番茄红素是类胡萝卜素途径中合成的第一个红色色素，是成熟番茄、芒果等的主要 色素。同时番茄红素是类胡萝卜素的重要中间产物，番茄红素在番茄红素环化酶(Lyc)的催 化下分子末端发生环化，进而合成各种类胡萝卜素(如叶黄素、胡萝卜素等）。理论上，下调 Lyc基因的表达可以抑制或阻断番茄红素转化为其他类胡萝卜素，从而在植物组织中降低下 游类胡萝卜素的合成，促进番茄红素的积累。目前，尚未见下调Lyc基因的表达进而有效调控 类胡萝卜素合成的报道。棉花全基因组测序表明，二倍体棉(雷蒙德氏棉，DD和亚洲棉，AA)基 因组包含5个Lyc基因，而异源四倍体的陆地棉(AADD)保留了来源于不同亚基因组的5对共 10个Lyc基因（表1)。根据种名+基因名+基因组的命名原则，将陆地棉的Lyc基因分别命名为 GhLyclA/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/D和GhLyc5A/D。序列比对表明，来源于不同亚 基因组的同对基因（直系同源基因）序列高度相似(相同核苷酸>98%)，而不同的旁系同源 基因间的序列相似度较低(35~78%)。存在多个且序列差异较大的Lyc基因增加了在棉花 中抑制番茄红素转化为其他类胡萝卜素的难度。本发明针对棉花的Lyc基因设计了能够靶标 多个棉花Lyc基因的RNAi元件(LycRNAi)。棉花转基因分析表明，该元件能全面下调陆地棉 10个Lyc基因的表达，并抑制类胡萝卜素的合成。
[0004] 表1不同种棉花的Lyc基因


【发明内容】

[0006] 本发明的技术创新点是设计了能同时靶标10个棉花Lyc基因，并显著抑制番茄红 素转化为其他类胡萝卜素的RNAi元件。
[0007] 本发明的技术方案是同时下调5对棉花番茄红素环化酶（Lyc)基因的RNAi元件 (LycRNAi)，所述的5对Lyc基因为GhLyc 1 A/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/D和GhLyc5A/ D〇
[0008] 具体的，所述RNAi元件包含由1个内含子序列隔开的2个反向重复序列，每一重复 序列包含分别来源于5对棉花Lyc基因的编码序列。
[0009] 具体的，所述的RNAi元件具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
[0010] SEQ ID No.6靶向5对棉花Lyc基因的LycRNAi元件(其中下划线所示为间隔序列）：

[0012]本发明还提供了同时下调5对棉花Lyc基因的植物表达载体，包含所述的RNAi元 件，该RNAi元件在植物体内转录。
[0013] 具体的，调控所述RNAi元件的启动子为组成型启动子。
[0014] 具体的，所述的启动子为CaMV35S启动子，具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。 [0015]具体的，所述的植物表达载体具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
[0016]本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞。
[0017]优选的，所述的宿主细胞为根癌农杆菌。
[0018] 本发明还提供了调控棉花类胡萝卜素的物质，其特征在于:其主要活性成分为所述 载体，或者所述的宿主细胞。
[0019] 本发明还提供了所述的RNAi元件，所述的植物表达载体，或所述的宿主细胞在调 控棉花类胡萝卜素含量和/或种类中的用途。
[0020] 本发明的有益效果:本发明通过研究和分析，确定在棉花中表达所述RNAi元件可 以有效抑制棉花10个Lyc基因的表达水平并降低类胡萝卜素的合成。该RNAi元件及相关载体 可用于调控棉花类胡萝卜素含量和种类，并在棉籽营养品质或纤维色彩的转基因改良方面 有着广阔的应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1: Ly cRNAi的表达载体T-DNA区的基因结构图
[0022] 2X35S，增强型花椰菜花叶病毒35S启动子;D1-D5,棉花Lyc基因序列，两个反向重 复的D1-D5串联序列及间隔序列构成LycRNAi元件;LycRNAi，番前红素环化酶Lyc基因的沉 默元件;GUS:NPTII，葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；T-Border(right)，T-DNA 右边界;T-Border (1 ef t)，T-DNA左边界。Nos，农杆菌胭脂碱基因终止子;35S，花椰菜花叶病 毒35S启动子。
[0023] 图2:pLGN-35S-LycRNAi表达载体构建流程
[0024]具体实验方法见操作过程实施例2 JX35S，增强型花椰菜花叶病毒35S启动子； D1-D5，棉花Lyc基因序列；LycRNAi，番茄红素环化酶Lyc基因的沉默元件;GUS:NPTII，葡萄 糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；T-Border (right)，T-DNA右边界；T-Border (left)，T-DNA左边界。Nos，农杆菌胭脂碱基因终止子;Kanamycin(R)，卡那霉素抗性基因； 35S，花椰菜花叶病毒35S启动子。相关酶切位点及位置在各个载体上标出。
[0025]图3:陆地棉A/D基因组中Ly c基因 RT-PCR引物的扩增验证及表达分析 [0026] 4，10个棉花1^(3基因的特异引物在陆地棉(61!)、雷蒙德氏棉(6〇和亚洲棉(6&)中 的扩增验证。B，LycRNAi转基因棉花不同转化子叶片中Lyc基因（GhLyclA/D、GhLyc2A/D、 GhLy c3A/D、GhLy c4A/D和GhLyc5A/D)的表达水平;WT代表非转基因棉花，数字显示不同的转 化子。
[0027]图4:野生型(WT)棉花及LycRNAi转基因植株叶片类胡萝卜素含量(mg/g)的变化。WT 为野生型叶片，数字显示不同转化子。
【具体实施方式】
[0028] 下述为实验操作中所用到的常规操作：
[0029] 1.DNA 的提取
[0030] 基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明 书。
[0031] 2.RNA 的提取
[0032] RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取，详细步骤见说明书。
[0033] 3.DNA片段的PCR扩增
[0034] 扩增体系如下：l〇XEx PCR buffer(Mg2+free)2.5yL，2.5mmol/L dNTPs 2yL， 25mmol/L MgCl2 2yL，引物l(5ymol/L)lyL，引物2(5ymol/mL)lyL，Ex Taq DNA聚合酶 1U，基 因组DNA约60ng，加入ddH20至25yL。
[0035] 扩增程序为：94Γ，5min; 94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，1 · 5min，35个循环；72°C 延伸lOmin。
[0036] 4.DNA片段的回收、连接和克隆
[0037] 使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4 DNA ligase进行DNA片段连接。 回收的片段与pUCm-T(上海生工)载体建立如下连接体系：10 X T4 DNA连接缓冲液lyL，载体 DNA片段lyL，外源连接产物DNA片段lyL，T4 DNA连接酶lyL，用双蒸水补足体积至10yL。载体 DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3，16°C连接12h。之后将连接产物转化大肠杆 菌DH5a。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证 后，在Invitrogen公司测序。
[0038] 5XUS组织化学染色
[0039] 由于实验室采用的表达载体具有⑶S报告基因 ，一般用⑶S组织化学染色检测跟踪 转基因。具体方法:取少量转基因棉花叶片(有伤口）置于96孔板中，加入GUS染液[0. lmo 1 /L K3Fe(CN)6,0.1mol/L K4Fe(CN)6,0.01mol/L Na2EDTA,500mg/L X-Gluc,1 %Triton X-100 (v/v)，0.14mo 1 /L磷酸钠缓冲液(pH7.0)]，在37 °C恒温条件下放置2h左右，再用75 %乙醇脱 色。植株叶片可被GUS染液染成特异蓝色的植株为转基因阳性。
[0040] 实施例1沉默元件的获得
[0041] 如前所述陆地棉含有5对Lyc基因，直系同源基因之间相似性极高（>98%)，而旁 系同源基因的核苷酸序列相似性较低，为完全抑制棉花中Lyc基因，我们从5个Lyc基因上各 选取一段序列（SEQ ID No. 1~5)，通过不对称PCR方法将5个序列串联，并最终形成含有间 隔序列的反向重复序列，即LycRNAi元件（SEQ ID No.6)。该沉默元件可祀定5对10个Lyc序 列从而通过RNAi机制下调番茄红素环化酶Lyc基因的表达水平。
[0042] 首先，用陆地棉基因组DNA为模板分别扩增出5个Lycl~5编码序列及间隔序列 (Lyc2序列包含一段编码序列及临接的内含子序列），引物为LyclF/R、Ly C2F/R、LyC3F/R、 Lyc4F/R、Lyc5F/R(表2)，方法同上述常规试验操作的DNA片段扩增。进一步用上述DNA片段 回收方法回收扩增的Lycl~5片段。
[0043] 表2 LycRNAi元件扩增引物序列
[0045]第二，利用不对称重叠 PCR方法将回收的5个Lyc片段串联。
[0046] 首先将Lycl和Lyc4、Lyc5和Lyc3串联。构建4个扩增体系如下：
[0047] (1)回收的 Lycl 片段约 5ng，2yL 引物 LyclF，lyL 引物 LyclR;
[0048] (2)回收的 Lyc3 片段约 5ng，lyL 引物 Lyc3F，2yL 引物 Lyc3R;
[0049] (3)回收的 Lyc4 片段约 5ng，lyL 引物 Lyc4F，2yL 引物 Lyc4R;
[0050] (4)回收的 Lyc5 片段约 5ng，2yL 引物 Lyc5F，lyL 引物 Lyc5R;
[0051 ] 扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为:94°C，5min; 94°C，30sec，56°C， 3〇86〇，72°(：，3〇86(3,30个循环;72°(：延伸31^11。分别将体系1和体系3混合、体系2和体系4混 合，56°C，lmin，72°C，3min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，目的条带Lycl+Lyc4和Lyc5+ Lyc3分别回收。
[0052]然后以Lycl+Lyc4和Lyc2为模板，进行Lycl+Lyc4与Lyc2的串联。构建2个扩增体系 如下：
[0053] (5)回收的 Lycl+Lyc4 片段约 5ng，2yL 引物 LyclF，lyL 引物 Lyc4R。
[0054] (6)回收的 Lyc2 片段约 5ng，lyL 引物 Lyc2F，2yL 引物 Lyc2R。
[0055] 扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为:94°C，5min;94°C，30sec，56°C， 30sec，72°C，30sec，30个循环；72°C延伸3min。将体系5和体系6混合，56°C，lmin，72°C， 3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收目的条带Lycl+Lyc4+Lyc2。
[0056] 进一步以Lyc5+Lyc3和Lycl+LyC4+LyC2为模板完成5个Lyc基因片段的串联。构建 如下两个扩增体系：
[0057] (7)回收的 Lyc5+Lyc3 片段约 5ng，2yL 引物 Lyc5F，lyL 引物 Lyc3R;
[0058] (8)回收的 Lycl+Lyc4+Lyc2 片段约 5ng，lyL 引物 LyclF，2yL 引物 Lyc2R。
[0059] 扩增体系其余成分同常规扩增体系。扩增程序为:94°C，5min; 94°C，30sec，56°C， 30sec，72°C，30sec，30个循环；72°C延伸3min。将体系5和体系6混合，56°C，lmin，72°C， 3min。扩增产物经琼脂糖电泳后，回收目的条带Lyc5+Lyc3+Lycl+Lyc4+Lyc2。
[0060] 在设计引物时，Lyc2引物的扩增片段包含了 Lyc2的编码序列以及临近的内含子序 列。该内含子用作间隔序列，有利于两个反向重复序列形成双链RNA。
[0061] SEQ ID N0.1:Lycl编码序列：
[0063] SEQ ID NO.2:Lyc2编码序列及临接内含子序列，下划线部分即为内含子序列：
[0071]最后用直接扩增发夹RNA的方法5以片段LyC5+LyC3+Lycl+Ly C4+LyC2为模板扩增 获得含间隔序列的5个Lyc片段的反向重复序列。反应体系中含回收的Lyc5+Lyc3+Lycl + Lyc4+Lyc2约5ng，2yL引物Lyc5F，lyL引物Lyc2R，其余成分同常规扩增体系。扩增程序为:94 °(：，5111丨11;94°(：，3〇86(3,56°(：，3〇86(3,72°(：，1111丨11，35个循环 ；72°(：延伸3111丨11。扩增产物经琼脂 糖电泳后，回收约1873bp的目的条带，按常规方法回收、克隆和测序验证，最终获得LycRNAi 元件（图lhLycRNAi元件依次包括Lyc5+Lyc3+Lycl+Lyc4+Lyc2(编码序列及相邻的部分内 含子序列)+Lyc2反向重复序列+Lyc4反向重复序列+Lycl反向重复序列+Lyc3反向重复序列 +Lyc5反向重复序列。
[0072] 实施例2 LycRNAi表达载体的构建
[0073] LycRNAi元件构建入植物表达载体pLGN-nos的流程见图SwLGN-nos载体是由传统 的植物表达载体PBI121改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(T-DNA左右边界 之间区域，图2)替换为组成型的35S启动子控制报告基因 GUS和标记基因 Nptll的融合基因 表达盒，以及另外的一个由35S启动子控制的表达盒。
[0074] LycRNAi载体构建过程为：用Hindm和BamHI将35S启动子从克隆载体上切下，连接 到用Hindm和BamHI酶切的pLGN-nos载体上构建pLGN-35S载体。进一步用EcoRI和BamHI将 LycRNAi元件从克隆载体上切下，插入到pLGN-35S载体的相应位点上，即获得最终的表达载 体?11^-353-1^^?嫩1。所有限制性内切酶均购自1?〇(*6公司，按照使用说明书操作。0嫩片段 的回收、连接和大肠杆菌转化按前述常规操作方法进行。参考Bio-RAD MicroPulser用户说 明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。
[0075]实施例3棉花的遗传转化
[0076]通过根癌农杆菌介导的方法进行上述表达载体的棉花遗传转化，所用培养基配方 见表3。具体方法如下:对野生型陆地棉冀棉14号饱满棉花种子进行脱壳，将少量(约20~40 颗)去壳后的种子置于灭菌后的100mL三角瓶中，先用75%酒精清洗种子lmin，轻轻倒出酒 精再加入0.1%升汞灭菌约12min(不断摇动三角瓶进行灭菌），轻轻倒出升汞，加入无菌水 充分漂洗，约漂洗10次，最后一次三角瓶中留有适量无菌水。置于摇床(30 °C、1 OOrpm)上，每 隔8小时更换一次无菌水，待胚根长出lcm左右（约36~48h)，将胚根轻轻插进萌发培养基 中，30°C暗培养至下胚轴伸长到3cm左右(约48h)。在进行种子的伸长培养期间活化农杆菌， 以备浸染所用。浸染前约20h，将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50mg/L卡那 霉素(Km)和125m g//L链霉素(Sm)的液体YEB培养基中，置于28°C摇床(200rpm)，培养约20h后 测量菌液的0D值（0D6qq)，0D6qq在0.8~1 ·0适宜转化。收集活化后的农杆菌液，8000rpm离 lmin，弃上清后用含有共培养液体培养基(含100μ mol/L乙酰丁香酮）的按1:1体积比重悬菌 体后收集重悬液于l〇〇mL三角瓶，置于摇床(30°C、100rpm)培养约20min。将下胚轴切成长约 lcm的小段，置于重悬液中并在摇床(30°C、100rpm)上浸染50min，弃液体再取出下胚段轻轻 放入固体共培养基表面，暗培养48h左右。暗培养后将下胚段转入固体筛选培养基中培养 (30°C、16h光照/8h黑暗，下同）15天后再转入固体下胚段生长培养基，每隔15d左右继代一 次至愈伤组织明显形成，将愈伤组织转到固体愈伤培养基上培养。将状态良好的胚性愈伤 转入液体悬浮培养基中并置于摇床(30°C、100rpm)上悬浮培养10d左右，通过筛网过滤将细 小体胚铺于体胚伸长培养基中至绿色体胚长出，将绿色体胚挑至体胚伸长培养基中继续培 养至长约lcm左右，插入生根培养基中直至幼苗长出。以上操作需在严格的无菌条件下完 成。
[0077]将筛选出的⑶S阳性转基因小苗种植于腐质土中温室炼苗2周后转种至大钵培养。 在温室中常规管理，并对植株生理性状及叶片中Lyc基因表达量以及类胡萝卜素含量进行分 析。
[0078]表3根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基
[0080] MS :Murashige&Skoog，1962; B5 :Gamborg，1986 ;Gelrite: Sigma，货号：G1910; SH: Schenk&Hildebrandt，1972。
[0081] 实施例4转基因棉花叶片中Lyc基因转录水平的检测
[0082] 首先设计针对10个棉花Lyc基因的基因特异定量PCR引物，并用常规PCR方法检测 引物特异性。如前所述，同对直系同源基因序列差异小，因此重点检查基因特异引物能否区 分同对直系同源基因 （GhLyc 1A和D、GhLyc2A和D、GhLyc3A和D、GhLyc4A和D，以及GhLyc5A和 D)。用常规方法提取陆地棉冀棉14(AADD)、雷蒙德氏棉(DD)和亚洲棉(AA)的基因组DNA。用2 XTaq Mix(Aidlab)扩增基因组DNA以检查引物特异性。扩增体系2XTaq Mix 12.5yL，上下 游引物（5nmol/L)各lyL，基因组DNA约100ng，加入ddH2〇至25yL。扩增程序为：94°C，5min; 94 °(：，3〇86(3,56°(：，3〇86(3,72°(：，1.51^11，30个循环;72°(：延伸1〇111丨11。扩增产物在含溴乙锭的琼 脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察照相。所有定量PCR引物序列见表4。
[0083] 表4定量PCR引物序列
[0085]提取WT及转基因棉花叶片的RNA，逆转录合成cDNA，然后进行荧光定量PCR。具体操 作步骤为：用反转录试剂盒(MBI公司）合成cDNA，操作与按试剂盒说明书一致。定量PCR在 CFX96定量PCR检测系统（Bio-Rad)上进行，在25yL的反应体系包括12.5yL 2XSuper Mix (Bio-Rad)，上下游引物各lyL(5ymol/mL)和lyL-链cDNA。温度循环参数为95°C预变性 211^11 ;95°(：，1〇86(3,57°(：，2〇86(3，扩增40循环。用棉花六(^1114基因作内标。用定量?0?仪自带 的分析软件Bio-Rad CFX Manager 3.0计算各个基因的相对表达量。
[0086]检测结果如附图3A，所有定量PCR引物均能明显区分不同（亚)基因组来源的直系 同源基因，即A-特异引物只能从含有A(亚)基因组的DNA(陆地棉和亚洲棉）中扩增出相应片 段，而D-特异引物只能从含有D(亚）基因组的DNA(陆地棉和雷蒙德氏棉）中扩增出相应片 段。这显示所有定量PCR引物均有很好的特异性。
[0087]进一步用这些引物检测野生型和LycRNAi转基因棉花叶片中的10个Lyc基因的表 达水平。结果显示（附图3B)，LycRNAi转基因棉花叶片中，所有Lyc基因的表达水平均较野生 型对照明显下降。这显示本发明提供的LycRNAi元件及其表达载体可以全面地下调棉花Lyc 基因的表达。
[0088]实施例5转基因棉花叶片类胡萝卜素含量测定
[0089] 参考萧浪涛的方法6测定转基因棉花及野生型叶片的类胡萝卜素含量。首先选取植 株同一生长位置的叶片(一般为倒四叶），直径为〇.6cm的打孔器于叶片各部位打孔取样，称 取O.lg左右(m)，加入10mL95%乙醇进行避光萃取12~24h;取200yL于酶标板中，分别测定 665nm、649nm和470nm处的吸光值（A665、A649和A470)。
[0090] 色素含量按如下公式计算：
[0091] 叶绿素 &((^) = 13.95八665-6.88八649;叶绿素 13(仏）=24.96八649-7.32八665 ;
[0092] 类胡萝卜素 (Cx) = (1000A47〇-2.05Ca-114.8Cb)/245;
[0093] 类胡萝卜素含量= CxX10-2/m(mg/g)。
[0094] 如附图4，LycRNAi转基因棉花叶片中的类胡萝卜素含量均较野生型明显降低，显示 LycRNAi元件在棉花中的表达可以最终影响转基因棉花体内类胡萝卜素的合成。
[0095] 参考文献
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【主权项】
1. 同时下调5对棉花番茄红素环化酶Lyc基因的RNAi元件LycRNAi，其特征在于:所述的 5 对 Lyc 基因为 GhLyclA/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/t^PGhLyc5A/D。2. 如权利要求1的RNAi元件，其特征在于:所述RNAi元件包含由1个内含子序列隔开的2 个反向重复序列，每一重复序列包含分别来源于5对棉花Lyc基因的编码序列。3. 如权利要求1或2所述的RNAi元件，其特征在于:所述的RNAi元件具有如SEQ ID No.6 所示的核苷酸序列。4. 同时下调5对棉花Lyc基因的植物表达载体，其特征在于:包含权利要求1或2所述的 RNAi元件。5. 如权利要求4所述的载体，其特征在于：调控所述RNAi元件的启动子为组成型启动 子。6. 如权利要求5所述的载体，其特征在于:所述的启动子为CaMV35 S启动子，具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。7. 如权利要求4~6任一项所述的载体，其特征在于:所述的植物表达载体具有如SEQ IDNo. 8所示的核苷酸序列。8. 含有权利要求4~6任一项所述的载体的宿主细胞。其特征在于:所述的宿主细胞为 根癌农杆菌。9. 转基因调控棉花类胡萝卜素合成的物质，其特征在于:其主要活性成分为权利要求3 ~6任一项所述载体，或者权利要求7或8所述的宿主细胞。10. 权利要求1~3任一项所述的RNAi元件，权利要求4~7任一项所述的载体，或权利要 求8或9所述的宿主细胞在调控棉花类胡萝卜素含量和/或种类中的用途。
【文档编号】A01H5/00GK105950620SQ201610270261
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】肖月华, 王肖, 姚丹, 王毅, 罗明, 侯磊, 裴炎
【申请人】西南大学