一种人β-防御素3基因果蝇诱导型表达载体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种人β?防御素3基因果蝇诱导型表达载体的制备方法，通过设计合成两对特异性引物H1，H2，H3和H4，得到了人β?防御素3基因片段，通过基因重组技术，将基因片段重组于pet28a载体上，构建pet28a?hBD?3重组载体，以pet28a?hBD?3重组质粒为模板，PCR扩增His?hBD?3片段，再将His?hBD?3片段插入到UASp?attB质粒中，制备果蝇表达载体UASp?attB?His?hBD?3。本发明提供了一种低成本、高效率制备人β?防御素3果蝇UASp诱导型转基因载体的制备方法，为下一步利用果蝇大量表达人防御素3蛋白奠定基础。
【专利说明】
-种人e-防御素3基因果蜗诱导型表达载体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种人0-防御素 3基因果蛹诱导型表达载体的制备方法，具体设及一 种人e-防御素 3基因片段及其制备方法，W及将此人0-防御素 3基因片段插入到果蛹载体上 制备果蛹诱导型表达载体的方法。
【背景技术】
[0002] 防御素是生物体内具有强烈抗菌作用的一类多肤物质，具有分子量小、水溶性好 及热稳定性强等特点。在抵抗外源有害微生物的反应中，具有抗菌谱广、无免疫原性、不易 使微生物产生耐药性等特点。此外，研究发现防御素还具有抗肿瘤作用。总之，防御素具有 独特的研究价值及很强的应用价值。迄今为止共发现五类:Q-防御素、e-防御素、0-防御素、 植物防御素和昆虫防御素。人类防御素包括a-防御素、0-防御素。0-防御素在人体皮肤和黏 膜上皮组织中广泛表达。其分子结构稳定，能够快速准确地识别并中和侵入机体的革兰阳 性、阴性细菌，对真菌、包膜病毒和某些寄生虫也会产生较强的杀伤作用，是宿主发挥天然 免疫的重要组成部分。此外，e-防御素还可W作为趋化因子连接先天性免疫和获得性免疫 应答，在人体多种疾病中发挥重要作用。
[0003] 人郎方御素 3化uma址-defensin-3，hBD-3)是2001年发现的第S种人源性郎方御素， 在抗菌活性等方面具有明显的优势。与hBD-巧化抓-2的成熟肤蛋白序列比较，h抓-3含有13 个A巧和Lys,比它们分别多6个和7个带正电荷的氨基酸，因此hBD-3(+ll)的电荷密度大约 是hBD-l(+4)和hBD-2(+6)的2倍，运对于hBD-3的抗菌活性可能有很大的提高W。相对于 h抓-1和hBD-2，hBD-3显示出更广的抗菌谱，对革兰阴性菌和阳性菌均有抗菌活性，对多重 耐药菌hBD-3也显示出强有力的抗性。运些特点使其有望成为一种新型肤类抗菌素。
[0004] 防御素大规模临床应用的最首要的问题是高生产成本。其一，防御素在生物体内 天然含量极少，天然资源有限;其二，化学合成法成本高，价格昂贵。而通过基因工程在工程 菌中直接表达防御素基因，易被细菌内部蛋白酶所降解，同时防御素可能对宿主具有毒性， 也限制了蛋白的高水平表达。如何提高防御素的产量，降低生产成本等问题成为目前防御 素生产实践应用中的瓶颈。
[0005] 目前，国内外对人0-防御素 3的研究，多集中在运用基因工程技术对其进行克隆与 表达上，具体包括基因的获取、重组表达载体的制备W及在细菌中高效表达。在原核生物 中，黄蓬亮等根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用偏好合成了人e-防御素 3,并在大肠杆菌中 诱导表达成功(生命科学研究，2005,9(2): 129-133)。李春丽等根据已知人0-防御素 3的成 熟区氨基酸序列和酵母密码子的偏好，人工合成人e-防御素 3基因，成功制备表达载体 pPIC9K-h抓3(河南农业大学报，2005,39(3):282-285)。何国庆等嵌合人0-防御素 3与植物 甜蛋白基因，在大肠杆菌中诱导表达后，目的蛋白约占总蛋白的30% (农业生物技术学报， 2005,13(2))。然而，在原核表达体系中所表达的防御素常常无生物活性。
[0006] 在真核表达系统中，庚晓哗等采用脂质体转染法将pcDNA3-hBD3重组载体导入 C0S-7真核细胞，对hBD3进行表达(军事医学，2004,28(4): 344-346)。蔡绍辉等运用植物转 基因技术，制备了人类人e-防御素 2的表达载体，并将此载体引入小麦的幼胚愈伤组织，为 随后的h抓-2的高表达创造了一定的条件（四川大学学报偃学版），2003,34(3):386)。吴 辟、陈艺等将人hBD-3基因转入酿酒酵母中进行表达，提取纯化蛋白，并对其抗菌活性进行 研究(现代食品科技，2012(9) :1123-1127)。夏章权等人制备人郎方御素 3化BD3)基因真核表 达质粒载体，观察其在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达，并检测了其活性(重庆医 学，2012,41(1):51-53)。
[0007] 1993 年，Brand 和化 rrimon 构建了最初的转基因 UAST 载体（development ,1993,118 (2) :401-415),后来发现，UAST转基因载体在果蛹生殖系统的卵子发生过程中不发挥作用， 基因没有表达。为了解决运个问题，1998年，Perni 11 e将UAST载体进行了改造，将UAS的数量 从5个提高到14个串联，构建出UASp载体(参见Proceedings of the化tional Academy of Sciences of the United States of America,1996,93(22):12418-12422和Mechanisms of development, 1998,78(1): 113-118)，该载体在果蛹生殖系统中的表达量得到明显提 高。其后，2007年Bischof等人继续对UAST载体进行改造，将细菌-隧菌体的attP-attB系统 引入到果蛹体系，通过转基因手段，首先在果蛹基因组上插入attP序列，然后在随机插入型 的转基因载体UAST上添加了attB序列，得到了 pUAST-attB定点插入型转基因载体 (Proceedings of the 化tional Academy of Sciences,2007,104(9) :3312-3317),大大 地缩短了转基因果蛹的制备时间。
【发明内容】
[0008] 基于W上情况，本发明提供了一种人e-防御素 3基因果蛹诱导型表达载体的制备 方法，通过基因工程的方法，制备了一种UASp高效诱导型表达人0-防御素 3载体，为下一步 利用果蛹大量表达人防御素 3蛋白奠定基础。
[0009] 本发明采取的技术方案为：
[0010] 人0 -防御素 3基因片段，所述基因片段的核巧酸序列如右所示： ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaaa 邑邑a邑邑aaca邑ate邑邑caa邑t邑etc邑ac邑C邑t邑邑CC邑Taaat邑Ct邑CC邑TCGTaa邑aaaTAAoltbSIS^tS；*^ GenBank中注册的人(6-防御素 3基因（GenBank登录号醒018661)序列相比，有少部分核巧酸 进行了改造，具体参见图12,但其编码的氨基酸序列没有改变。经改进后的人0-防御素 3基 因，其表达水平将会提高。
[0011] 选取运一片段构建果蛹诱导型表达载体的原因在于:GenBank中注册的人0-防御 素 3基因片段的长度为138个核巧酸，包括编码45个氨基酸的肤段、1个终止密码子TAA。此45 个氨基酸肤段即人郎方御素 3基因的成熟肤序列IINTLQKYYCRVRGGRC AVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRK r (参见文献 Journal Of Biological Chemistry ,2001,276(8) :5707-13),此成熟肤具有很强的抗菌功能。
[001^ 本发明还提供了人0-防御素 3基因片段的制备方法，将四条特异性引物化、H2、H3 和H4经PCR扩增，且在Hl和H4中分别引入BamHl和化nd虹限制性酶切位点。所述四条特异性 引物序列如下：
[0013] Hl:5 ' -aaaGGATCCggaatca1:aaacacattacagaaatat1:attgcCGTgtcCGTgg-3 '，下划线 表示带有BamHl酶切位点；
[0014] H2:5 ' 一cttt邑邑aa邑邑Ca邑ct邑a邑caca邑cacaAc邑邑CC邑ccACG邑acACG邑caataa-3 '；
[0015] H3:5 ' 一ctca邑Ct邑ccttccaaa邑邑a邑邑aaca邑ate邑邑caa邑t邑etc邑ac邑C邑t邑邑CC-3 '；
[0016] H4:5 '-tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3 '，下划线 表示带有化ndm酶切位点。H1、H4引物中也可引入其它限制性内切酶位点，如Hl引物中的 BamHl可替换为EcoRl酶切位点;H4引物中的化nd虹可替换为化Ol酶切位点。
[0017] 由于人的基因组模板难W获得，故将138bp的hBD-3基因分为四部分，设计出四条 引物（即化、肥、册、^)，每条引物大约506口左右，利用引物搭桥的方法，将四种引物混合后 进行PCR扩增10个循环，获得大量的人hBD-3基因。
[0018] 本发明还提供了一种人0-防御素 3基因果蛹诱导型表达载体的制备方法，所述制 备方法包括W下步骤：
[0019] (1)根据上述的人0-防御素 3基因片段的制备方法得到人0-防御素 3基因片段；
[0020] (2)将人0-防御素 3基因片段插入到pet28a载体中，制备pet28a-h抓-3重组载体；
[0021] (3)^步骤(2)得到的96*28曰-11抓-3重组质粒为模板少0?扩增化3-11抓-3片段；
[0022] (4)对UAST-attB载体进行改造，构建UASp-attB载体；
[0023] (5)将步骤(3)得到的His-hBD-3片段插入到步骤(4)得到的UASp-attB载体中，审U 备果蛹诱导型表达载体UASp-attB-His-h抓-3。
[0024] 所述步骤(2)具体包括W下步骤:用限制性内切酶BamHl和化nd虹双酶切0-防御素 3基因片段和pet28a载体，将0-防御素 3基因片段插入到pet28a载体的BamHl和化nd虹之间。 此步骤中也可使用其它限制性内切酶进行双酶切，如EcoRl与化Ol。为了把hBD-3带上化S标 签，除了可W把hBD-3基因插入到pet28a载体上，插入到其它原核表达载体上也可W实现， 如pRSETB质粒载体。
[0025] 进一步地，所述步骤(2)还包括pet28a载体酶切后加入CIAP，37 °C解育30分钟，再 用T4连接酶将人h抓-3基因插入到pet28a载体的BamHl和化nd虹之间。
[00%]所述步骤（3)具体包括W下步骤：W步骤（2)得到的pet28a-h抓-3重组质粒为模 板，册，册为特异性引物，PCR扩增化s-h抓-3片段，所述册，册为特异性引物如下：
[0027]册:5 ' -AAAggtaccATGGGCAGCAGCCATC-3 '，下划线表示带有 Kpnl 酶切位点；
[00 巧]册：5 ' -TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3 '，下划线表示带有 Notl 酶切位点。 在PCR扩增化s-hBD-3片段时，引入除Kpnl和Notl限制性酶切位点时，将册引物中的Kpnl换 成Ascl，也能实现本发明。
[0029] 所述步骤(4)具体包括W下步骤：
[0030] 参照UASp序列（GenBank登录号AY831681.1)合成引物H7和册。WUASp转基因果蛹 品系（美国bloomington果蛹中屯、库，库编号为23269)的基因组DNA为模板，WH7、册为引物 PCR扩增UASp片段。将扩增的UASp片段和UAST-attB质粒用限制性内切酶Sbn和Xbal酶切， 用T4连接酶16°C过夜连接，转化，即可得到UASp-attB质粒载体；
[0031] 所述H7、册引物序列如下：
[0032] H7:5 ' -aaaCCTGCAGGATCTACTTTCCGCAAAAATGGG '，下划线表示带有訊 fl 酶切位点； [00；33]册：5 ' -aaaTCTAGagcggccgctgg 化 ccggcgcgccAATGAACAGGACCTAACGCACAGTC-3，，下 划线表示带有Xbal、Notl、Kpnl、Ascl酶切位点。其中Xbal作为接头，与Sbn共同引入UASp片 段。其余巧巾酶AscUKpnl和Notl作为UASp下游的多克隆酶切位点，用来插入外源片段；
[0034] 所述PCR扩增条件为:95°C预变性3min，然后运行热循环:95°C变性15s，55°C退火 15s，72°C延伸253,35个循环后于72°(：继续延伸5111^。
[0035] 所述步骤巧)具体包括W下步骤:首先用限制性内切酶Kpnl和Notl双酶切步骤(3) 得到的化s-hBD-3片段、W及步骤(4)得到的UASp-attB质粒，然后将化s-h抓-3片段插入到 UASp-attB质粒的Kpnl和Notl之间。
[0036] 进一步地，所述步骤(5)还包括UASp-attB质粒酶切后加入CIAP，37°C解育30分钟， 再用T4连接酶将化s-h抓-3片段插入到UASp-attB质粒的Kpnl和Notl之间。
[0037] 目前尚无人0-防御素 3在果蛹体内成功表达的报道，本发明利用基因工程技术，提 供了一种低成本、高效率制备人e-防御素 3基因果蛹UASp诱导型表达载体的制备方法。
【附图说明】
[003引图1为PCR扩增h抓-3基因。泳道M为化b DNA Marker(DNA长度的标准参照片段），泳 道1为在紫外光下可见138bp目的条带，与理论符合；
[0039] 图2为hBD-3基因片段与pet28a载体分别用BamHl和化nd虹双酶切后的纯化产物。 泳道M为沈b DNA Marker，泳道1为hBD-3基因酶切产物，泳道2为pet28a载体酶切产物；
[0040] 图3为重组质粒pet28a-h抓-3的PCR鉴定。泳道M为2kb DNA Marker,泳道V'为阳 性对照，泳道1-15为在紫外光下可见138bp目的条带，为阳性转化子，泳道为阴性对照； [00川图4为重组质粒96*28曰-1180-3的8曰111化、化11(1虹双酶切鉴定。泳道1为15邮0論 Marker，泳道1 -3为阳性转化子的酶切条带；
[0042] 图5为化s-hBD-3片段的扩增。泳道M为化b DNA Marker,泳道1为在紫外光下可见 约24化P左右的目的条带，与理论符合；
[0043] 图6为UASp片段的扩增。泳道M为2kb DNA Marker,泳道1为在紫外光下可见约 750bp左右的目的条带，与理论符合；
[0044] 图7为重组载体UASp-attB的PCR鉴定。泳道M为化b DNA Marker,泳道V'为阳性对 照，泳道2、4、6、8、9等分别为阳性转化子，在紫外光下可见约750bp左右的目的条带，泳道 为阴性对照；
[0045] 图8为重组载体UASp-attB的訊n、Xbal双酶切鉴定。泳道M为15化DNA Marker,泳 道1为阳性转化子的酶切条带；
[0046] 图9为重组质粒UASp-attB-His-h抓-3的PCR鉴定。泳道M为化b DNA Marker，泳道 1-14为转化子PCR产物，泳道为阴性对照，泳道V'为阳性对照，其中上下游鉴定引物朋 与册分别位于UASp载体上及片段内部，目标片段大小为50化P左右；
[0047] 图10为重组质粒UASp-attB-His-hBD-3的K叩UNotl双酶切鉴定。泳道M为15化 DNA Marker,泳道1-3分别为1号、2号和3号阳性转化子的酶切条带；
[004引图11为果蛹诱导型表达载体UASp-attB-His-h抓-3示意图；
[0049] 图12为人hBD-3基因成熟肤改造前后的序列。
【具体实施方式】
[0050] 本发明中所设及的载体、试剂、材料、引物的来源如下：
[0051 ] pet28a载体、pRSETB质粒、大肠杆菌D册a感受态细胞:购自北京普如汀生物技术有 限公司；
[0052] 碱性憐酸水解酶CIAP、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHl、Hind虹、Sbf 1、时nl、 No 11、甜a 1和As C1购自TaKaRa公司；
[0053] pUAST-attB载体由东南大学生命科学研究院惠赠；
[0化4] 果蛹:基因型为7^*;口{1^5口-￥。口.1?曰64}09，购买自美国61〇〇1111叫1〇11果蛹中屯、库， 该果蛹品系的库编号为23269;
[0055] 9条引物化1-H9)均由上海生工生物工程有限公司合成与纯化。
[0化6] 实施例1
[0057] -种人0-防御素3基因果蛹诱导型表达载体的制备方法，所述制备方法包括W下 步骤：
[0化引1.1人0-防御素 3基因化抓-3基因）的获取及扩增
[0059] 本着不改变氨基酸序列的原则，对人hBD-3基因成熟肤138个核巧酸的编码序列进 行了改造，W提高其表达水平。序列改造如下：
[0060] 人hBD-3基因成熟肤改造前序列：
[0061] <'gg过过tc过t过过过C过C过tt过C过g过过过t过tt过ttgc过g过gtc过g过ggcggccggtgtgctgtgctc过gctgccttcc过过 aggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgaaaatgctgccgaagaaagaaataa^
[0062] 人hBD-3基因成熟版改造后序列：
[0063] "ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgetcagetgccttccaa aggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccg了aaatgctgccg了CG了aagaaata过，>
[0064] 依据改造后的目标序列，设计合成2对特异性的引物（即化，肥，册，拟）四条搭桥引 物，且在化和H4中分别引入限制性酶切位点BamHl和化nd虹。
[00化]Hl:5 ' -aaaGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTgg-3 '，带有 BamHl酶切位点（下划线表示）；
[0066] H2:5 ' 一ettt邑邑aa邑邑Ca邑Ct邑a邑caca邑cacaAc邑邑CC邑ccACG邑acACG邑caataa-3 '；
[0067] H3:5 ' -ctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggcc-3 '；
[0068] H4:5 ' -tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3 '，带有 化nd虹酶切位点（下划线表示）。
[0069] 将四条引物加入PCR反应体系中，PCR扩增条件如下:95°C变性3min进入循环，95°C 变性15s，55°C退火15s，72°C延伸1〇3，10个循环后于72°(：继续延伸5111111，得到目的基因片 段，将此PCR产物纯化后作为模板，利用引物化和H4大量扩增，PCR扩增条件如下:95°C变性 3min进入循环，95°C变性153,55°(：退火153,72°(：延伸1〇3,30个循环后于72°(：继续延伸 Smin，最后得到末端带有BamHl和化nd虹酶切位点的138bp的hBD-3目的基因片段，如图1所 /J、- O
[0070] 1.2 pet28a-h抓-3重组质粒的制备
[0071] 将上述的PCR产物纯化后和pet28a载体分别用限制性内切酶BamHl和化nd虹双酶 切，37°C-个小时，pet2&i载体再加入化1的CIAP，37°C解育30分钟（如图2)，再用T4连接酶 将人hBD-3基因插入到pet28a质粒中，16°C过夜连接。将连接产物导入到大肠杆菌D册a感受 态细胞中，在含有氨节抗性的固体培养基中挑选阳性克隆，采用PCR扩增(如图3)和双酶切 (BamHl和化nd虹）鉴定重组质粒(如图4)。从图中可W看出：图3显示出一条138bp的片段，图 4显示pet28a-h抓-3质粒经BamHU化nd虹双酶切后得到一条138bp小片段(条带较弱）和一 条约化b的大片段。证明有138bp的外源片段插入到了质粒中，PCR与双酶切的结果均表明， 已成功制备了 pet28a-h抓-3载体。将阳性克隆的菌液样品送至生物公司测序，将测序结果 与设计的目标序列进行比对。结果表明，插入到pet28a载体中的人hBD-3基因 138bp长度的 编码序列完全正确，具体序列如下：
[0072] "ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttccaa 曰gg曰gg曰曰C曰g曰tcggc曰曰gtgctcg曰CgCgtggCCgT曰曰曰tgctgccgTCGT曰曰g曰曰曰TAA''。
[0073] 1.3 His-h抓-3片段的扩增
[0074] 设计一对特异性引物（即册，H6 )，在册和H6中分别引入Kpn 1和Not 1限制性酶切位 点，W上述制备的pet28a-h抓-3质粒为模板，PCR扩增His-h抓-3片段。PCR扩增条件如下：95 。(:变性3min进入循环，95°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸1〇3,30个循环后于72°(：继续延 伸5min，得到目的基因片段。如图5所示，PCR产物为一条240bp的条带，与理论相符，证明得 到了化s-h抓-3基因片段。
[0075] 册：5'-AAAgg化ccATGGGCAGCAGCCATC-3'，带有Kpnl酶切位点（下划线表示）；
[0076] H6 : 5 ' -TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3 '，带有Notl酶切位点（下划线表 示)。
[0077] His-h抓3序列如下：
[007引 "ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTG GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgT tgtgCtgtgCtC3gCtgCCttCC333gg3gg33C3g3tCggC33gtgCtCg3CgCgtggCCgT333tgCtgCCgTCG T过过g过过过D
[0079] 上述序列中上游10化P为带有六个组氨酸标签(6址is)的小肤（下划线表示），编码 34个氨基酸残基。下游138bp为人hBD3基因的编码序列，编码45个氨基酸残基。此融合序列 为后续的蛋白质纯化提供了便利。
[0080] 1.4 UASp-attB载体的构建
[0081 ] 参照UASp序列（GenBank登录号AY8 31681.1)设计两条引物H7和册，在H7和册中分 别引入限制性酶切位点Sbn和Xbal等酶切位点。Wbloomington库中编号为23269的果蛹 (y V*; P化ASp-YFP. Rab4} 09)的基因组DNA为模板、WH7和册为引物，PCR扩增UASp片段。
[0082] PCR扩增条件如下:95°C变性3min进入循环，95°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸 25s，35个循环后于72°C继续延伸5min，得到目的基因片段(如图6)。其PCR结果如图6所示， 图6显示出一条75化P左右的条带，与理论相符，证明得到了 UASp片段。
[0083] 将扩增的片段和pUAST-attB质粒分别用訊n和Xbal双酶切，用T4连接酶将目的片 段与pUAST-aUB质粒载体共解育，16 °C过夜连接，将连接产物转化D册a感受态细胞，挑选阳 性克隆摇菌12小时，进行菌液PCR鉴定。PCR鉴定结果如图7所示，Sbfl和Xbal双酶切鉴定结 果如图8所示。图7显示扩增出一条约750bp的片段，图8显示UASp-attB质粒经訊n和Xbal双 酶切后得到一条约750bp的小片段和一条约9肺的大片段，证明有约750bp的外源片段插入 到了质粒中。PCR和酶切结果均显示，已成功制备了UASp-attB质粒载体。
[0084] H7 : 5 ' -aaaCCTGCAGGATCTACTTTCCGCAAAAATGGG'，带有 Sbfl 酶切位点（下划线表 示)；
[00化]册：5 '-aaaTCTAGagcggccgctgg化ccggcgcgccAATGAACAGGACCTAACGCACAGTC-3'，带 有甜曰1、齡1：1、邱]11和43(31酶切位点（下划线表示）。
[0086] UASp序列如下(下划线字母表示接头序列）：
[0087] cctgcaggATCTACTTTCCGCAAAAATGGGTTTTATTAACTTACATACATACTAGAATTGGCCGCTCTAGCCCCCCC TCGAATGTTCTCTCTCTTCTCTTCTCTCTCTCTTTCTCGAATGTTCTCTCTCTTCTCTTCTCTCTCTCTTTCTCGAG GTCATCAAGCTTAGGCCTCCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTA CTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTC CGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGG CGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTACTGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGCGGAGTAC TGTCCTCCGGGCTGGCGGAGTACTGTCCTCCGGCAAGGGTCGAGTCGATAGCCGAAGCTTACCGAAGTATACACTTA AATTCAGTGCACGTTTGCTTGTTGAGAGGAAAGGTTGTGTGCGGACGAATTTTTTTTTGAAAACCGGTGATAGAGCC TGAACCAGAAAAGATAAAAGAAGGCTATACCAGTGGGAGTACACAAACAGAGTAAGTTTGAATAGTAAAAAAAATCA TTTATGTAAACAATAACGTGACTGTGCGTTAGGTCCTGTTCATTggcgcgccgg1:accagcggccgctctaga。
[008引 1.5果蛹表达载体UASp-attB-His-h抓-3质粒的制备
[0089] 将上述扩增得到的化s-hBD-3片段和UASp-attB质粒分别用Kpnl和Notl进行双酶 切，UASp-attB质粒酶切后再加入化1的CIAP，37 °C解育30分钟;然后用T4连接酶将His-h抓- 3片段与UASp-attB质粒16°C过夜连接，将连接产物导入到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，在 含有氨节抗性的固体培养基中挑选阳性克隆，PCR鉴定结果如图9所示，Kpnl和Notl双酶切 鉴定结果如图10所示。图9显示采用上游引物朋(位于UASp载体上）及下游引物H6对转化子 的克隆进行PCR扩增鉴定，得到一条大小为500bp左右的片段。图10显示UASp-attB-Ws- h抓-3质粒经KpnUNotl双酶切后得到一条约24化P的小片段和一条约9肺的大片段，证明成 功制备了果蛹表达载体UASp-attB-Hi s-h抓-3。将阳性克隆的菌液样品送至生物公司测序， 将测序结果与24化P的化s-h抓3目标序列比对。结果表明，His-h抓3融合序列24化P的编码 序列完全正确，具体序列如下：
[0090] "ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTG GTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgT tgtgCtgtgCtC3gCtgCCttCC333gg3gg33C3g3tCggC33gtgCtCg3CgCgtggCCgT333tgCtgCCgTCG T过过g过过过D
[0091] H9:5 '-TCCTCCGGCAAGGGTCGAGTCGATA。
[0092] W上结果表明，经上述方法成功制备了果蛹表达载体UASp-attB-His-h抓-3。
[0093] 实施例2
[0094] -种人0-防御素 3基因果蛹诱导型表达载体的制备方法，所述制备方法包括W下 步骤：
[0095] 将实施例1步骤I. I中的H1、H4引物的酶切位点分别替换为EcoRl、化Ol限制性酶切 位点，并将1.2步骤中的双内切酶替换为EcoRl和化Ol限制性内切酶，其它与实施例1相同。
[0096] 实施例3
[0097] -种人0-防御素 3基因果蛹诱导型表达载体的制备方法，所述制备方法包括W下 步骤：
[009引将实施例1步骤1.2中的pet28a质粒载体替换为pRSETB质粒载体，制备了pRSETB- h抓-3质粒载体，WpRSETB-h抓-3质粒载体为模板，册和册为引物，PCR扩增化s-h抓-3片段， 其它同实施例1。
[0099] 实施例4
[0100] -种人0-防御素 3基因果蛹诱导型表达载体的制备方法，所述制备方法包括W下 步骤：
[0101] 将实施例1步骤1.3中的册引物中的Kpnl酶切位点替换为Ascl酶切位点，其它同实 施例1。
[0102] 上述参照实施例对人0-防御素 3基因果蛹诱导型表达载体的制备方法进行的详细 描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离 本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种人β-防御素3基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如下： ggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTggcggccgTtgtgctgtgctcagctgccttc caaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggccgTaaatgctgccgTCGTaagaaaTAA〇2. 根据权利要求1所述的人β_防御素3基因片段的制备方法，其特征在于:设计四条特 异性引物Hl， Η2，Η3和Η4，且在Hl和Η4中分别引入BamHl和Hindm限制性酶切位点，进行PCR扩增，所 述四条特异性引物如下： Hl: 5 ' -aaaGGATCCggaatcataaacacattacagaaatattattgcCGTgtcCGTgg-3 '，下划线表不 带有BamHl酶切位点； H2:5 '-ctttggaaggcagctgagcacagcacaAcggccgccACGgacACGgcaataa-3 '； H3:5?-ctcagctgccttccaaaggaggaacagatcggcaagtgctcgacgcgtggcc-3 ?; H4:5 ' -tttAAGCTTTTAtttcttACGAcggcagcatttAcggccacgcgtcgagcact-3 '，下划线表亦 带有HindIE酶切位点。3. -种人β-防御素3基因果蝇诱导型表达载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法 包括以下步骤： (1) 根据权利要求2所述的人β-防御素3基因片段的制备方法得到人β-防御素3基因片 段； (2) 将人β-防御素3基因片段插入到pet28a载体中，制备pet28a-hm)-3重组载体； (3) 以步骤(2)得到的pet28a-hm)-3重组质粒为模板，PCR扩增His-hm)-3片段； (4) 对UAST-attB载体进行改造，获得UASp-attB载体； (5) 将步骤(3)得到的His-hBD-3片段插入到步骤(4)得到的UASp-attB质粒中，制备果 绳表达载体 UASp-attB-His-hBD-3。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下步骤:用限 制性内切酶BamHl和Hindm双酶切β-防御素3基因片段和pet28a载体，将β-防御素3基因片 段插入到pet28a载体的BamHl和Hindm之间。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)还包括pet28a载体酶切 后加入CIAP，37°C孵育30分钟，再用T4连接酶将人hBD-3基因插入到pet28a载体的BamHl和 Hindm之间。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：以步 骤(2)得到的pet28a-hm)-3重组质粒为模板，以H5和H6为特异性引物，PCR扩增His-hBD-3片 段，所述H5与H6特异性引物的序列如下： H5:5 ' -AAAggtaccATGGGCAGCAGCCATC-3 '，下划线表示带有 Kpnl 酶切位点； H6:5 ' -TTTgcggccgcTTAtttcttACGAcggcagc-3 '，下划线表示带有 Not 1 酶切位点。7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括以下步骤： 以果蝇的基因组DNA为模板，H7、H8为引物PCR扩增UASp片段； 将扩增的UASp片段和pUAST-attB质粒用限制性内切酶Sbfl和Xbal酶切，用T4连接酶16 °C过夜连接，转化，即可得到UASp-attB质粒载体； 所述H7、H8引物序列如下： H7:5 ' -aaaCCTGCAGGATCTACTTTCCGCAAAAATGGG '，下划线表示带有Sbfl 酶切位点； Η8:5 ' -aaaTCTAGagcggccgctggtaccggcgcgccAATGAACAGGACCTAACGCACAGTC-3 '，下划线 表示带有Xbal、Notl、Kpnl和Ascl酶切位点。8. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)具体包括以下步骤:用限 制性内切酶Kpnl和Notl双酶切步骤(3)得到的His-hBD-3片段和步骤(4)得到的UASp-attB 质粒，将His-hBD-3片段插入到UASp-attB质粒的Kpnl和Notl之间D9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)还包括UASp-attB质粒酶 切后加入CIAP，37°C孵育30分钟，再用T4连接酶将His-hBD-3片段插入到UASp-attB质粒的 Kpnl和Notl之间D
【文档编号】C12N15/12GK105925585SQ201610559462
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】陈冬生, 王双
【申请人】安徽师范大学