Cyp3a5蛋白、编码基因、重组载体及其在制备抗肿瘤复发或转移药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了CYP3A5蛋白、编码基因、重组载体及其在制备抗肿瘤复发或转移药物中的应用，该蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其编码基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该蛋白能够抑制肝癌细胞的转移和侵袭能力，其在抗肿瘤复发或转移药物中的制备中具有非常广阔的应用前景。
【专利说明】
CYP3A5蛋白、编码基因、重组载体及其在制备抗肿瘤复发或转 移药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及CYP3A5蛋白、编码基因、重组载体及其 在制备抗肿瘤复发或转移药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，肝细胞癌是最致命的恶性肿瘤之一，在世界范围内占肿瘤相关死亡率的第 三位，更是肝硬化病人死亡的首要原因。据报道，2008年新诊断的肝细胞癌病人超过70万， 按年龄分层，每10万人中，就有新诊断的肝细胞癌病人16个。经过仔细筛选的早期肝脏肿瘤 病人，通过肝切除术，肝移植和射频消融，可以得到有效的治疗。但晚期肿瘤病人，尽管经过 积极的综合治疗，因为术后复发转移，预后依然很差。因此，鉴定新的肝癌进展分子标记，并 深刻理解肝癌术后转移复发的分子机制，对于阻止肿瘤复发，延长患者生存依然十分重要。 [0003] 细胞色素 P450酶系（cytochrome P450enzyme system，CYPs)是参与外源化合物解 毒和内源化合物代谢的重要酶系。人类共有18个细胞色素 P450酶基因家族和43个亚家族， 涉及大多数药物代谢的酶系主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族。细胞色素 P450家族通过其对 内源性和外源性物质(包括抗肿瘤药物)的代谢在肿瘤的发生和发展中起到重要作用，其中 CYP3A亚家族成员作用尤为突出，其含量最多、底物谱大，是药物代谢反应中最主要的限速 酶。CYP3A亚家族包括4个成员：CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43，串联排列于7q22.1长约 231kb的基因座内。由于CYP3A7主要表达于胎肝，而CYP3A43最近才被发现，其具体功能尚不 够明确，现今针对CYP3A亚家族研究最多的是它的2个主要成员：CYP3A4、CYP3A5,两者共催 化50%以上的临床常用药物的氧化、还原反应。由于CYP3A4能够活化前致癌物，以及参与抗 肿瘤药物代谢，因此其在肿瘤发生、发展中的作用已得到充分研究;有文献报道CYP3A4与肿 瘤的恶性表型呈正相关，且过表达CYP3A4能够在体外促进肝癌细胞增殖。CYP3A5是研究得 最深入的CYP3A亚家族低丰度成员，但现有研究仍主要集中在CYP3A5与肿瘤发生和药物代 谢的关系这两个方面，且现有研究成果主要是流行病学领域的结果，对于CYP3A5在抗肿瘤 尤其是抗肝癌的研究结果很少、甚至是没有。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种CYP3A5蛋白，此CYP3A5蛋白具有抗肿瘤复发或转移的 功能。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述CYP3A5蛋白的编码基因，该编码基因能够编码上 述CYP3A5蛋白。
[0006] 本发明的另一目的在于提供含有上述编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或 表达盒。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤复发或转移的药物，该药物的活性成分为 上述CYP3A5蛋白，或者该药物含有上述重组载体。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述CYP3A5蛋白、编码基因、重组载体、重组菌、重组 细胞或表达盒在制备肿瘤复发或转移药物中的应用。
[0009] 本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0010] -种CYP3A5蛋白，该蛋白具有抗肿瘤复发或转移功能，且该蛋白的氨基酸序列如 下（1)或(2)所示：
[0011] (l)SEQ ID N0.1；
[0012] (2)将SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加的衍生序列。
[0013] 上述蛋白的编码基因，该编码基因的的核苷酸序列如下（I)或（II)所示：
[0014] (I)SEQ ID NO.2；
[0015] (II)将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/ 或添加的衍生序列。
[0016] 上述蛋白或编码基因在制备抗肿瘤复发或转移药物中的应用。
[0017] 本发明提供的CYP3A5蛋白、编码基因、重组载体及其在制备抗肿瘤复发或转移药 物中的应用有益效果是:本发明提供的蛋白即CYP3A5蛋白，能够显著的抑制肿瘤细胞尤其 是肝癌细胞的迀移及侵袭能力，具有抗肿瘤复发或转移的功能，能够适用于作为预防肝癌 复发或转移的靶点，可应用于制备抗肝癌复发或转移的药物中，该药物可对肝癌复发及转 移起到预防作用。
【附图说明】
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对 范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。
[0019] 图1为本发明实施例的CYP3A5蛋白对肝癌细胞迀移能力的影响图；
[0020] 图2为本发明实施例的CYP3A5蛋白对肝癌细胞侵袭能力的影响图；
[0021 ]图3为本发明实施例的CYP3A5蛋白对肝癌细胞粘附能力的影响图；
[0022]图4为本发明实施例的CYP3A5蛋白抑制肝癌细胞体内转移能力的影响图；
[0023] 图5为本发明实施例的CYP3A5蛋白对裸鼠存活率的统计分析结果图。
【具体实施方式】
[0024] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产 品。
[0025] 下面对本发明实施例的CYP3A5蛋白、编码基因、重组载体及其在制备抗肿瘤复发 或转移药物中的应用进行具体说明。
[0026] CYP3A5蛋白是细胞色素 P450酶系整个家族中的一员，现有的研究表明CYP3A5蛋白 主要参与了药物代谢尤其是抗肿瘤药物的代谢过程中。而本发明人在长期的研究过程中首 次发现该CYP3A5蛋白具有抗肿瘤复发或转移功能，该CYP3A5蛋白的氨基酸序列如下如SEQ ID NO. 1所示。
[0027]需要说明的是，将SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加，且具有抗肿瘤复发或转移功能的衍生序列，也属于本发明的保 护范围。
[0028] 此外，编码上述CYP3A5蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0029] 需要说明的是，将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的置换和/ 或缺失和/或插入、且编码出的蛋白具有同SEQ ID N0.2所编码的蛋白具有相同的抗肿瘤复 发或转移功能的衍生序列，也属于本发明的保护范围。
[0030] 此外，本发明先构建了含有上述编码基因的表达盒、重组菌、真核表达载体或病毒 载体，再通过转染或感染的方式，将上述编码基因导入肝癌细胞，并在该肝癌细胞中稳定表 达出了CYP3A5蛋白，结果显示，稳定表达CYP3A5蛋白的肝癌细胞与对照细胞(未表达CYP3A5 蛋白），稳定表达CYP3A5蛋白的肝癌细胞的迀移、侵袭、粘附等转移相关能力均受到显著性 抑制。
[0031 ]由此表明，CYP3A5蛋白可作为抗肿瘤复发或转移药物的靶点，CYP3A5蛋白能够应 用在制备抗肿瘤复发或转移的药物中，尤其是应用在制备抗肝癌复发或转移的药物中。当 然，编码上述CYP3A5蛋白的编码基因、含有编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或表达 盒均可在制备抗肿瘤复发或转移药物中进行应用。
[0032]其中，该药物可以是含有CYP3A5蛋白或以CYP3A5蛋白作为活性成分的药物，此外， 该药物还可以是含有携带有上述编码基因的重组载体。
[0033]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0034] 实施例1
[0035] 本实施例提供了 CYP3A5蛋白，CYP3A5蛋白的编码基因、含有该编码基因的表达盒、 重组载体、重组菌。
[0036] 1.构建携带有CYP3A5蛋白的编码基因的载体
[0037] 携带有CYP3A5蛋白编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CYP3A5和携带有CYP3A5蛋 白编码基因的慢病毒表达质粒lenti-CYP3A5-GFP均由上海吉凯基因化学技术有限公司构 建。其中，CYP3A5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，CYP3A5蛋白编码基因的的核苷酸 序列如SEQ ID N0.2所示。
[0038] 实施例2
[0039] 本实施例提供了含有CYP3A5蛋白的编码基因的病毒载体例如慢病毒载体、以及重 组细胞。
[0040] 1.载体转化以构建SMMC-7721及HCC-LM3两种过表达CYP3A5蛋白的稳定细胞系
[00411 取生长状态良好的SMMC-7721及HCC-LM3细胞分别传至6孔板，待细胞汇合率为 60%-70%时，加入含有上述lenti-CYP3A5-GFP的无血清DMEM培养基(Μ0Ι = 20)，继续培养8 ~9小时，然后更换成新鲜的含血清的DMEM培养基。再培养6~10天，使用流式细胞仪分选有 绿色荧光的细胞既为CYP3A5过表达稳定细胞系。分别得到SMMC-7721及HCC-LM3两种过表达 CYP3A5蛋白的稳定细胞系。
[0042] 实施例3
[0043]本实施例提供了上述CYP3A5蛋白在抑制肿瘤细胞例如肝癌细胞的复发或转移中 的应用。
[0044] 1.体外实验以检测过表达CYP3A5蛋白对肝癌细胞的迀移能力以及侵袭能力的影 响
[0045] 将上述得到过表达CYP3A5蛋白的慢病毒载体转化的SMMC-7721及HCC-LM3细胞，作 为处理组;将表达GFP蛋白的慢病毒载体转化的SMMC-7721及HCC-LM3细胞，作为对照组。检 测过表达CYP3A5蛋白对肝癌细胞SMMC-7721及HCC-LM3的转移及侵袭能力的影响。
[0046] (1)采用Transwell法检测处理组和对照组的肝癌细胞迀移能力具体步骤如下。
[0047] 用预温的DMEM重新水化Matrigel precoated transwell内室2h;分别消化上述得 到的过表达CYP3A5蛋白的SMMC-7721和HCC-LM3细胞，再用无血清DMEM重悬细胞；调整细胞 数量至1.5 X 105个/孔；内室加入300μ1无血清DMEM，外室加入750μ1含10 %FBS的DMEM培养 基，孵育24~48h;孵育结束后，将内室用4%中性甲醛固定30min;用细棉签擦去内室侧细 胞;用0.1%的结晶紫染色30min;显微镜下拍照并统计5个视野的细胞数量，取平均值。 [0048] 结果如图1所示，由结果可知，无论是SMMC-7721细胞还是HCC-LM3细胞，其处理组 的视野内平均细胞数明显少于对照组(P〈〇.01)，说明处理组的肝癌细胞的迀移能力明显小 于对照组，由此表明，过表达CYP3A5蛋白能够明显地抑制肝癌细胞的迀移能力。
[0049]由图2可知，无论是SMMC-7721细胞还是HCC-LM3细胞，其处理组的视野内平均细胞 数明显少于对照组(P〈〇.01)，说明处理组的肝癌细胞的侵袭能力明显小于对照组，由此表 明，过表达CYP3A5蛋白能够明显地抑制肝癌细胞的侵袭能力。
[0050] (2)检测处理组和对照组对细胞外基质的粘附能力
[0051] 肿瘤细胞对于细胞外基质(ECM)的粘附是肿瘤细胞转移中一个非常重要的过程， 是肿瘤侵袭和转移的第一步，也是关键的一步，研究肿瘤细胞对细胞外基质的粘附能力有 助于理解其进一步的转移能力。
[0052]采用上海缔达生物科技有限公司的细胞粘附性检测试剂盒，按试剂盒说明书操 作，对处理组和对照组对细胞外基质的粘附能力进行检测。结果如图3所示，由图3的结果可 知，无论是SMMC-7721细胞还是HCC-LM3细胞，其处理组的视野内平均细胞数明显少于对照 组(P〈0.01)，说明处理组的肝癌细胞对纤维粘连蛋白的粘附能力明显小于对照组，由此表 明，过表达CYP3A5蛋白能够明显地抑制肝癌细胞的对细胞外基质的粘附能力。
[0053] 实施例4
[0054]本实施例提供了上述CYP3A5蛋白在抑制肿瘤细胞例如肝癌细胞的体内复发或转 移中的应用。
[0055] 1.动物实验以检测过表达CYP3A5蛋白对肝癌细胞的转移能力以及对生物体生存 期的影响
[0056] (1)为进一步验证过表达CYP3A5蛋白对于肝癌细胞在体内侵袭转移能力的影响， 本实验通过裸鼠尾静脉注射稳定感染的SMMC-7721处理组细胞及相应SMMC-7721对照细胞 (两组均为5只裸鼠），建立了体内肺转移的模型，观察裸鼠肺转移的情况；10周后处死所有 裸鼠，检测其裸鼠肺转移灶数目和体积。结果如4所示。
[0057]由图4可知，处理组裸鼠肺的转移灶数目明显少于对照组，且处理组裸鼠肺的体积 也明显小于对照组，由此表明，过表达CYP3A5蛋白在体内同样能够抑制肝癌细胞在体内的 转移侵袭能力。
[0058] (2)本实验通过裸鼠尾静脉注射稳定感染的S丽C-7721处理组细胞及相应S丽C- 7721对照细胞(两组均为10只裸鼠），建立了体内肺转移的模型，观察裸鼠肺90天生存情况， 其结果如图5所示。
[0059]由图5可知，处理组裸鼠肺的存活率(50.0% )明显地高于对照组(9.1 % )，处理组 具有更好的预后(P = 〇.0286)，由此表明，过表达CYP3A5蛋白能够提高肝癌患者的存活率。 [0060] 实施例5
[0061]本实施例提供了一种抑制肝癌细胞复发或转移的抑制剂，该抑制剂的活性成分为 上述CYP3A5蛋白，也就是说，该抑制剂可以含有CYP3A5蛋白，或者含有能够表达CYP3A5蛋白 的重组载体或编码CYP3A5蛋白的编码基因。
[0062]此外，本实例还提供了一种抗肿瘤复发或转移的药物，该药物的活性成分为上述 CYP3A5蛋白，也就是说，该抑药物可以含有CYP3A5蛋白，或者含有能够表达CYP3A5蛋白的重 组载体或编码CYP3A5蛋白的编码基因。
[0063]综上，CYP3A5蛋白具有抑制肝癌细胞复发或转移的功能，是一个全新的抗肿瘤的 靶点，该结果克服了对该蛋白的认识上的偏见，并进一步阐述了CYP3A5蛋白的新功能。因 此，该蛋白能够用于制备抗肝癌复发或转移的药物或者用于制备抑制肝癌细胞复发着转移 的抑制剂中，其具有广阔的应用前景。
[0064]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种CYP3A5蛋白，其特征在于，所述CYP3A5蛋白具有抗肿瘤复发或转移功能，且所述 CYP3A5蛋白的氨基酸序列如（1)或(2)所示： (1) SEQ ID NO.l； (2) 将SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加的衍生序列。2. 权利要求1所述CYP3A5蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如（I)或（II)所 示： (I) SEQ ID NO.2； (II) 将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添 加的衍生序列。3. 含有权利要求2所述编码基因的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒。4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为慢病毒载体、逆转录 病毒载体或腺病毒载体中的一种。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体在所述编码基因的上游 或下游含有促进所述编码基因表达的增强子。6. -种抗肿瘤复发或转移的药物，其特征在于，其活性成分为权利要求1中所述CYP3A5 蛋白。7. -种抑制肿瘤细胞复发或转移的抑制剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1中所 述CYP3A5蛋白。8. 权利要求1所述的蛋白或者权利要求2所述的编码基因在制备抗肿瘤复发或转移药 物中的应用。9. 权利要求3所述的重组载体、重组菌、重组细胞或表达盒在制备抗肿瘤复发或转移药 物中的应用。10. 根据权利要求8~9任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。
【文档编号】A61P35/00GK105969744SQ201610594803
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】王红阳, 陈磊
【申请人】王红阳, 陈磊