无抗性双功能dna疫苗载体、构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种无抗性双功能DNA疫苗载体，同时还设及该DNA疫苗载体的构建 方法和应用，属于动物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] DNA疫苗值NA vaccine)又称核酸疫苗或基因疫苗（genetic vaccine)，它的发现 被誉为第S次疫苗革命。DNA疫苗可W诱导机体的细胞免疫和体液免疫，其制备简单，生产 成本低，遗传背景清晰，便于构建多价苗和添加多种免疫佐剂分子等。目前大多数的质粒载 体都W抗生素抗性基因作为其选择性标记，运一环境安全性问题严重制约着DNA疫苗的发 展和应用。伴随着抗生素的广泛应用甚至是滥用，抗生素耐药性基因的扩散问题日益严重， 现已成为全球共同关注的问题。耐药性基因不断向环境中漂移扩散，不仅破坏微生态平衡， 还导致超级细菌的出现（如NDM-1)。近年来出现的多种超级细菌就是由抗性基因的扩散引 起，在临床上无药可医，给社会带来极大恐慌。而无抗性DNA疫苗载体的构建能够避免抗性 基因扩散所带来的一系列问题。
[0003] 利用减毒沙口菌作为载体传递DNA疫苗是目前基因免疫研究的热点。减毒沙口 菌拥有一个有效的运送重组抗原的系统，运些抗原可来自多种病原体，包括细菌、病毒和寄 生虫的抗原，甚至肿瘤抗原（潘志明，唐丽华，黄金林等.作为疫苗和疫苗载体的减毒细 菌.微生物学杂志，2005, 25巧）：78-82.)。应用基因工程技术对沙口菌减毒后，虽然其毒 力降低，但其侵袭力并未发生明显的改变，可将DNA疫苗直接运送到抗原递呈细胞内，诱导 机体产生体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫应答，使机体不仅能抵抗相应外源病原的攻击，同 时还能抵抗沙口菌的感染，运使得减毒沙口菌成为携带病毒或细菌DNA的有效载体化i Y H, Wang S F,Xin W, et al.A sopB Deletion Mutation Enhances the Immunogenicity and Protective Efficacy of a Heterologous Antigen Delivered by Live Attenuated Salmonella enterica Vaccines. Infection And Immunity, 2008,76(11):5238-5246.)。减 毒沙口菌重组DM疫苗免疫动物时，通过口服途径即可刺激黏膜免疫，操作简单方便，并且 其向宿主免疫系统递呈抗原蛋白的方式与自然感染相似。同时，沙口菌脂多糖具有免疫佐 剂的作用，能够增强免疫应答（国凤英，卢±红，许自亮等.口服携带人PF4基因的减毒沙 口氏菌对大剂量化疗小鼠的促造血重建作用.中国生物工程杂志，2005, 25(2) : 12-18.)。 减毒沙口菌重组DNA疫苗制备简单（只需培养细菌），生产成本低，将为新型口服DNA疫苗 的研制提供一条新的思路。目前，减毒沙口菌已广泛用于细菌、病毒、寄生虫、肿瘤等疫苗载 体。实验结果证明多数减毒沙口菌株作为载体传递DNA疫苗具有良好的免疫原性，能够起 到良好的免疫效果（李文桂，陈雅棠.细菌重组减毒鼠伤寒沙口氏菌疫苗研究进展.动物 医学进展，2004, 25 (2) : 49-53.)。
[0004] 因此，构建W营养选择标志基因asd代替抗性基因作为选择压力的沙口氏菌染色 体-质粒平衡致死系统有着十分重要的意义，可用于研制新型无抗性口服DNA疫苗，具有巨 大的市场价值和广阔的应用前景。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供一种无抗性双功能DNA疫苗载体，W营养选择标志基因asd 替代抗生素抗性基因，从根本上消除抗生素抗性基因扩散所带来的安全性问题。
[0006] 同时，本发明还提供一种无抗性双功能DNA疫苗载体的构建方法。
[0007] 最后，本发明还提供一种无抗性双功能DNA疫苗载体在制备无抗性DNA疫苗中的 应用。
[000引为了实现W上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 无抗性双功能DNA疫苗载体，该载体为真核表达质粒，全长4058bp (图谱见图1，A、 B分别展示不同的酶切位点），其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。其中，1732~2872bp为 SD-asd 基因片段，2873 ~3970bp 为 pUCori 片段，其余为化mv-MCS-BGHpA-f lori 片段，。
[0010] 无抗性双功能DNA疫苗载体的构建方法，包括W下步骤：
[0011] 1) W平衡致死系统载体PYA3493质粒为模板，扩增SD-asd基因；
[0012]2)用BspHI和XmnI双酶切真核表达质粒PCDNA3. 1-Zeo (+)，去除Amp抗性基因， 回收 1814bp 的片段 F^cmv-MCS-BGHpA-flori;
[0013]3)用XmnI和Sail双酶切真核表达质粒PCDNA3.1-Zeo (+)，去除Zeo抗性基因，回 收 1099bp 的片段 pUCori;
[0014] 4)将 SD-asd 基因、Pcmv-MCS-BGHpA-n〇ri、pUCori 进行连接，构建长度为 4058bp 的无抗性双功能DM疫苗载体。
[0015] 步骤1)中扩增SD-asd基因的引物序列如沈Q ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0016] 无抗性双功能DNA疫苗载体在制备无抗性DNA疫苗中的应用。例如在无抗性双 功能DNA疫苗载体的多克隆位点插入（人或动物疾病）外源保护性抗原基因，并将其应用 到asd基因缺陷的革兰氏阴性菌群中，尤其是asd基因缺失的减毒沙口氏菌中，构建沙口氏 菌染色体-质粒平衡致死系统，制备无抗性DNA疫苗。沙口氏菌asd基因缺失菌株如采用 鼠伤寒沙口菌化1344 A crp A asd菌株（田芳华，程相朝等.鼠伤寒沙口菌化1344株 A C巧A asd缺失株的构建及生物学特性初步研究，中国兽医学报，2013, 11:1700-1706.)。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明利用营养选择标志替代抗生素抗性基因作为无抗性双功能DNA疫苗载体 的筛选标记（抗生素抗性基因被完全切除），构建真核表达质粒pcD-asd，能从根本上阻断 抗生素抗性基因的扩散传播，安全性好，并且具有高表达效率和高拷贝数。运是由于DNA疫 苗载体pcD-asd的SD-asd基因缺少相应的启动子，仅保留SD序列，搭配高效的复制起始点 PUCori,能够增加该质粒的拷贝数。
[0019] 本发明中无抗性双功能DNA疫苗载体能够与asd基因缺陷的革兰氏阴性菌（如减 毒沙口氏菌鼠伤寒化1344 A C巧A asd)互补，构建染色体-质粒平衡致死系统，该系统感 染293T细胞后，可观察到较强的巧光，同时该系统可在普通的LB培养基上连续传70次，质 粒不丢失，证实该系统在真核细胞内高效稳定表达外源基因，可用作核酸疫苗的表达载体。
[0020] 本发明中真核表达质粒pcD-asd可利用减毒伤寒沙口氏菌为载体构建双价、多价 活菌苗，该种疫苗无任何抗性标记，遗传背景清晰，性状稳定，制备简便，易于体外大规模培 养，可经口服接种途径进行免疫，使用方便，安全性好，成本低，可发挥减毒沙口菌活载体的 天然免疫佐剂效应及诱导机体产生强烈的特异性细胞免疫和粘膜免疫应答能力的优势，从 而增强DNA疫苗的免疫效果，具有显著的经济和社会效益。同时，还能降低抗生素抗性基因 扩散的潜在危险性，从根本上消除扩散所带来的安全性问题。
【附图说明】 阳02U 图1为本发明无抗性双功能DM疫苗载体的图谱； 阳02引图2为无抗性双功能DNA疫苗载体的构建示意图； 阳〇2引 图3为SD-asd基因片段电泳图；
[0024] 图4为HN基因PCR产物的电泳图；
[0025] 图5为重组质粒pcD-asd-HN酶切电泳图； 阳0%] 图6为重组质粒pcD-asd酶切电泳图；
[0027] 图7为重组质粒pcD-asd稳定性试验电泳图；
[0028] 图8为重组质粒pcD-asd-EGFP酶切电泳图；
[0029] 图9为质粒转染293T细胞巧光显微图；
[0030] 图10为重组减毒沙口菌感染293T细胞的巧光显微图。
【具体实施方式】
[0031] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。 阳0巧实施例1 阳03引本实施例中无抗性双功能DNA疫苗载体pcD-asd是基于PCDNA3. 1-Zeo (+)改造构 建的，构建示意图见图2,具体操作如下：
[0034]1)扩增非抗生素抗性基因天冬氨酸P -半乳糖脱氨酶（SD-asd)，W平衡致死系统 载体PYA3493质粒（美国华盛顿大学化.Roy ^diss III教授惠赠）为模板，根据已发表 的平衡致死系统载体PYA3493质粒基因序列，设计一对分别引入XmnI、Sail限制性内切酶 酶切位点的上、下游引物（分别如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示）：
[0035]上游引物：5' -CGGAATTAATTCgcacatctctttgcagg-3^ 狂mnl 酶切位点），
[0036]下游引物：5' -ACGC GTCGAC ctacgccaactggcgcag-3' (Sail 酶切位点），
[0037]用 rTaq 酶 PCR 扩增 SD-asd 基因。扩增体系为：10XPCR Buffer 2. 5 y L ;dNTPs 各（200umol/L) 1 y L jTaq 酶 2U/ y L;上游引物 / 下游引物各 lOOpmol ;Mg2+l. 5mmol/L 0. 5 y L ;模板（PYA3493) 2ug ;加 d地2〇 至 25 y L。扩增程序为：94°C，5min ;94°C，Imin ;56°C， Imin ;72°C，Imin ;30个循环；72°C，lOmin。扩增出的目的条带大小为ll"bp (含酶切位 点）（见图3,图中M:DL2000Mark;l :水对照；2,3 :SD-asd基因片段），连接PMD19-T载体。 连接体系为：PMD19-T 巧Ong/ul) 0. 5 y L ;T4DNA 连接酶 2. 5U/ y L 5. 0 y L ;SD-asd 基因片段 0. 5pmol;加d地2〇至lOL。采用常规的热击法转化大肠杆菌JM109,挑选阳性单菌落送上海 英驗生物技术有限公司进行测序； 阳0測 2)pcDNA3. l-Zeo(+)载体氨卞基因（Amp抗性基因）的去除
[0039] a)Bs抑I、XmnI双酶切PCDNA3. 1-Zeo (+)载体，酶切反应体系如下：
[0040]
[0041] 37°C解育4小时后，加入终止液混匀终止反应；
[0042] b)琼脂糖电泳，回收ISOObp左右的大片段化mv-MCS-BGHpA-n〇ri，4°C保存备 用；
[0043] 3)pcDNA3. 1-Zeo(+)载体病毒复制相关部分SV40ori、SV40pA及博来霉素抗性基 因的去除
[0044] a) BspHI酶切PCDNA3. 1-Zeo(+)载体，酶切反应体系如下：
[0045]
[0046] 37°C解育4小时后，加入终止液混匀终止反应；
[0047] b)琼脂糖电泳，回收4000bp左右PCDNA3. 1-Zeo (+) -AmpR片段（表示切除）， 回收产物测定浓度，4°C保存备用；
[0048] C)Sail酶切PCDNA3. 1-Zeo (+) -AmpR片段，酶切反应体系如下：
[0049]
[0050] d)琼脂糖电泳，回收llOObp左右pUCori片段，4°C保存备用；
[0051] 4)SD-asd基因片段、pUCori片段及化mv-MCS-BGHpA-flori片段的连接，反应体系 如下：
[0052]
[0053]在加入连接酶之前，混合液于45°C保溫5min后立即冷却至0°C，再加入10 X反应 缓冲液和T4DNA连接酶混匀16 °C连接过夜后加入终止液终止反应；
[0054] 5)SD-asd基因片段、pUCori片段及化mv-MCS-BGHpA-f lori片段的连接产物转化 X6097 阳化5] 从-70°C冰箱内取出大肠杆菌X6097感受态细胞，于冰上融化，将10 y L连接产物 与100化感受态细胞小屯、无菌混匀，之后转移至1个无菌试管中，冰浴30min，再42 °C热 激90s，立即放入冰水中静置2. 5min (2~3min均可），加入500 y L预热的LB液体培养基， 37°C 15化/min振摇培2.化(2~化均可），将培养液均匀涂布LB固体培养基（预热），37°C 培养过