一种使烟草获得马铃薯y病毒抗性的方法及vigs载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用RNA沉默技术诱导植物抗性技术领域，特别是一种使烟草获得马 铃薯Y病毒抗性的方法及VIGS载体。
【背景技术】
[0002] 烟草是我国重要的经济作物。烟草马铃薯Y病毒病（PotatovirusY，PVY)在烟 草上引起严重花叶坏死斑和坏死条斑，植株矮小。马铃薯Y病毒寄主范围广泛，可侵染茄科 多种植物，烟草上马铃薯Y病毒主要靠蚜虫传播。根据近年调查发现：烟草PVY的危害日益 严重，防治困难，严重影响烟草的产量和品质，已造成巨大的经济损失。目前针对烟草马铃 薯Y病毒病缺乏有效地药剂防治，外加烟株上经常存在复合侵染，加大病害的防治难度。选 育抗性品种成为不失成为一种有效方式，但抗性品种选育时间慢、抗性基因缺乏，有诸多局 限。随着分子生物学的发展，RNA干扰为病毒防治提供了一条新途径。
[0003] RNA沉默技术在植物中发生常称为共抑制（Co-suppression)或转录后基因沉默 (Posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)，在果幡等动物中发生常称为RNA干扰（RNA interference，RNAi)，在真菌中发生常称为基因抑制（Quelling)。1990 年RichJorgensen 在矮牵牛中发现一种转基因同时抑制自身和相应内源基因表达的基因沉默现象。后来人 们以拟南芥位研宄模型，发现基因沉默发生的同时，转录后加工成熟的mRNA却大大减少。 1998年AndrewFire和CraigMello将双链dsRNA正义链和反义链的混合物注入线虫，结果 诱发了单独注射强得多的基因沉默。病毒诱导的基因沉默（Virus-inducedgenesilence， VIGS)是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒基因组cDNA导入植株并表达后，诱发 RNA介导的防御机制（RNA-mediateddefence，RMD)，同时诱发与插入片段同源基因的表达 沉默。早在20世纪20?30年代期间，人们就发现感染了病毒温和株系的植株可以抵御 随后的温和株系及与其亲源关系相近的强毒株系病毒的侵染，即交叉保护现象。进一步研 宄发现，交叉保护现象是由于病毒诱导产生了RNA沉默，使植株产生了对该病毒的抗性，即 病毒诱导的基因沉默。后来在转基因植株中出现了类似的现象，即病毒接种的初期，病毒正 常增殖，接种叶片表现出被病毒感染的症状。但随着病毒在植株中的系统扩散，植株的新生 叶片中虽仅含有少量的转入基因，但表现出对该病毒的抗性。
[0004] 目前普遍接受的时双链RNA模型假说。长的dsRNA被RNAseIII家族的Dicer酶识 另IJ，并切割成具有21-23nt的双链RNA(siRNA)，siRNA与一些酶和相关因子共同组成RNA介 导的沉默复合体（RISC)，在ATP的作用下，沉默复合体由解旋酶解开siRNA的双链，使沉默 复合体（RISC)转变成活性复合体（siRNA的双链解旋后形成的一种稳定的活性结构形式）； 其次，由siRNA的反义链引导复合体与革巴mRNA的特异序列杂交，在RdRp(RNAdirection RNAploymerase)的催化下，以siRNA的反义链为引物、革ElmRNA为模板，合成新的长链 dsRNA，新合成的长链dsRNA被核酸内切酶切割成21-23ntsiRNA，这些新生成的siRNA和 有活性的RISC重新进入以上循环。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA，使靶 mRNA渐进性地减少，有效地抑制了mRNA翻译的形成，从而有效地阻止了靶向基因蛋白质或 多肽的合成，使病毒表现出基因沉默现象。同时结合了RISC的靶mRNA因缺乏poly(A)尾 巴和稳定头部的保护，也会被内切酶切割。
[0005] Ratciff等将其改造成TRV的RNA1和RNA2cDNA的双元表达载体，并利用TRV载 体成功使转基因烟草的绿色荧光蛋白基因沉默。TRV是目前应用最广的VIGS载体，具有沉 默效率高且效果持久、各种组织均可产生沉默等优点，介导基因沉默同时不会带来病毒诱 导的症状，改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染，因而已被广 泛应用于烟草、番茄、马铃薯、碧冬茄、辣椒等多种茄科植物。
[0006] 马铃薯Y病毒辅助蛋白酶（HelperComponent-Proteinase，HC-Pro)蛋白是类似 木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶，具有双重功能，既是蚜虫传毒的辅助成分，又具有蛋白酶活 性，其C-末端可以自动将HC-Pro从多聚蛋白上切割下来。根据其已知功能HC-Pro可分为 三部分：N-端、C-端和中间区域。其中HC-ProN-端控制着病毒的蚜传、致病性、基因组的 扩增和病毒的积累；中间区域具有影响病毒的长距离移动、协生作用、基因组的扩增、抑制 RNA沉默和维持病毒的复制等功能。
[0007] 因为马铃薯Y病毒在烟草上的传播主要是蚜虫传毒，所以选用对蚜虫传毒有重要 影响的HC-Pro基因作为抗马铃薯Y病毒的靶标基因，但到目前为止，通过基因沉默原理，特 异性的沉默马铃薯Y病毒HC-Pro基因使烟草获得马铃薯Y病毒抗性的方法还未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种使烟草获得 马铃薯Y病毒抗性的方法，以及该方法涉及到的VIGS载体。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种使烟草获得马铃薯Y 病毒抗性的方法，该方法步骤如下：
[0010] (1)制备含VIGS载体的根癌农杆菌；该VIGS载体的靶标序列为马铃薯Y病毒 HC-Pro序列；
[0011] (2)烟苗剪叶后喷施上述根癌农杆菌和PBNTRA6根癌农杆菌的体积比为1 :1的混 合菌液，使根癌农杆菌侵染剪叶烟苗，通过侵染将HC-Pro基因片段导入烟草。
[0012] 本发明同时提供一种以马铃薯Y病毒基因为靶标的VIGS载体，所述VIGS载体的 靶标序列为HC-Pro序列。
[0013] 本发明还保护转化有上述VIGS载体的菌株，其出发菌株为根癌农杆菌GV3101。
[0014] 本发明目的在于，以烟草马铃薯Y病毒脉坏死株系为材料，构建靶向HC-PRO基因 的VIGS载体，诱发烟草自身防御机制的同时，干扰烟草马铃薯Y病毒在植物体内的复制、运 输、致病性和传播，并使病毒失去保护作用，达到防御烟草马铃薯Y病毒病的目的。本发明 区别现有技术的思路是：构建的使烟草产生马铃薯Y病毒抗性的VIGS载体的沉默对象是入 侵病毒的HC-Pro基因，而非植物本身基因。
[0015] 本发明以种植普通烟草为试材，以烟田危害广泛的马铃薯Y病毒为靶标病毒进行 具体实验验证，实验数据显示，喷施菌液的烟草获得良好的PVY病毒抗性。基于本发明的构 思，说明书中记载的实验方法的指导以及本领域普通技术人员所具备的常规实验技能，本 领域技术人员可以将本发明的方法应用到多种烟草病毒病，这种应用都在本发明请求保护 的范围内。
【附图说明】
[0016] 图1是含PVYHC-PRO基因片段载体的构建。
[0017] 图2是含马铃薯Y病毒脉坏死株系马铃薯总RNA提取的电泳图。
[0018] 其中：从左至右，第1-6泳道：含马铃薯Y病毒脉坏死株系马铃薯总RNA提取，可以 观察到有明显的两条带，证明RNA提取成功，可进行反转录；第7泳道：2kplusmark。
[0019] 图3是马铃薯Y病毒HC-Pro基因PCR扩增电泳图。
[0020] 其中，M:2kplusmark;1 :退火温度54°C;2 :退火温度58°C;6 :阴性对照。
[0021] 图4是PTV00-HC-Pro载体质粒酶切电泳图。
[0022] 其中，M:2Kplusmark1 :PTV00-HC-Pro质粒；2 :PTV00-HC-Pro质粒酶切，显示二 条带。
[0023] 图5是大田验证PTV00-HC-Pro的转入。
[0024] 其中，1-12 :田间试验随机采样，反转录后用PTV00R/PTV00FPCR扩增，除2孔和 9孔为阴性，其余10个样本为阳性;M:2Kplusmark。
【具体实施方式】
[0025] 本发明中所有引物皆由上海生工生物工程公司合成。
[0026] 实施例1PVY的HC-PRO基因的克隆及测序验证
[0027] 马铃薯Y病毒（PotatovirusY，PVY)是马铃薯Y病毒属中的典型种，对马铃薯、 烟草等重要经济作物危害相当严重，特别是PVY坏死株系（PVYN)可以造成寄主植物提前死 亡而绝产。
[0028] 本发明针对马铃薯Y病毒（PVY)脉坏死株系的HC-PRO基因设计引物：HC-ProF:5 ' -ATGGATCCTGGCTGAGTTTAGGCGGAAGA-3' (如SEQIDNo. 2 所示），HC-ProR: 5'-TCGGTACCTG ATACCCAGTCGTTTGTGAG-3' (如SEQIDNo. 3所示），下划线部分为引入的酶切位点，采用PCR 方法克隆PVY的HC-PRO基因，具体步骤如下：
[0029] 提取含马铃薯Y病毒总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪检测其质量和浓 度，见图 2,通过反应体系（RNA50ng_5ug、Anchoredoligo(dT)Primerlul、2*TSRection Mix10ul、EnzymeMixlul、gDNARemoverlul、去RNA水补足至 20ul)进行反转录成cDNA。
[0030] 利用引物HC-PROF/HC-PROR，以该马铃薯Y病毒cDNA为模板，进行PCR扩增，获得 PVY-HC-PR0基因片段，见图3。其中，PCR反应体系为：10XPCR缓冲液2ul、DNA模板lul、 dNTP1.6ul、上下游引物各0. 8ul、Taq酶0. 4ul、去离子水补足至20ul;PCR反应条件为： 94°C3min预变性，94°C30sec变性；50-68°C30sec退火；72°Clmin延伸（目的片段大于 500bp用1分钟，小于500bp用40秒），35个循环，72°C10min，4°C保存。
[0031]对PCR产物（PVY-HC-Pro基因片段）进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收该 PVY-HC-PR0基因片段，将该回收片段与载体T1CloningVector(购自北京全式金生 物技术有限公司）连接，取l〇ul连接产物，转化大肠杆菌感受态细胞（感受态大肠杆 菌TransTlChem