一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用
【技术领域】
[0001] 构建重组质粒pMA5-sat表达NTC抗性基因和运用抗性质粒表达葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶基因zwf提高核黄素产量属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 诺瓦丝菌素Norseothricin (NTC)是一种链丝菌素Streptothricin类抗生素，能 够抑制蛋白质的合成和正确编码。NTC被广泛运用于细菌、真菌、酵母、植物细胞等的抗性筛 选，是一种对阳性筛选子没有副作用的一种抗生素。并且，NTC易溶于水，并且在4°C水溶液 中可稳定保存2年。实验证实，由基因sat编码的链丝菌素乙酰基转移酶，能够乙酰化NTC 的0-赖氨酸的0-氨基，使NTC失活。
[0003] 实验室前期选育了一株核黄素高产菌BacillussubtilisRF1，多次实验证明该 菌株对于氨苄霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素等都有抗性，所以对于该菌株的抗性筛造成 了困难。但是，通过实验证明该菌株不能够在浓度为20mg/L的NTC抗性培养基中生长。于 是，我们考虑构建一种新型的抗性筛选质粒。而质粒PMA5作为一种稳定的穿梭质粒，被广 泛运用于枯草芽孢杆菌的表达系统中。所以，我们尝试将抗性基因sat整合到质粒pMA5上 构建出一种能够抗NTC抗生素的新型的抗性质粒。
[0004] 核黄素是一种维生素，又称维生素B2,是人和动物体必需的维生素之一，为黄素酶 类辅酶的组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸（FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD) 的形式存在，参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重 要作用，是生命活动中不可缺少的维生素。其中，在枯草芽孢杆菌中，核黄素的合成以GTP 和核酮糖-5-磷酸（P5P)为前体物经过7步酶催化反应得到，并且整个过程可以总结为下 列反应方程式：3P5P+Gly+14ATP+2NADPH+2C1 -riboflavin+3NADH+2formate。所以核黄素 的过量合成存在两个假说的瓶颈：一是前体物GTP和核酮糖-5-磷酸的有限供应；二是催 化合成过程的酶的有限供应和活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是葡萄糖进入磷酸戊糖途的一 个关键酶，课题组对前期选育的原始菌BacillussubtilisRF1的磷酸戊糖途径的关键酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行加强表达以提高磷酸戊糖通量，一方面获得更高水平的前体物 核酮糖-5-磷酸的积累，另一方面也提高了核黄素合成所需NADPH的剂量。从而提高核黄 素的产量。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要研宄内容：本发明利用分子技术克隆了链丝菌素因乙酰基转移酶基 因sat，构建重组抗性表达载体pMA5_sat，并将其转化BacillussubtilisRF1，得到重组菌 BacillussubtilisRFl/pMA5_sat，并且重组菌能够在NTC抗性平板上稳定地生长。实验 结果表明，重组质粒能够在宿主菌中正常表达抗性基因sat，使NTC抗生素失活，从而构建 出一种新型的NTC抗生素抗性质粒。
[0006] 首次运用抗性质粒pMA5_sat在核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1加强表达 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，得到重组菌Bacillus subtilis RFl/pMA5-sat_zwf,并成 功提高了核黄素产量，说明重组质粒pMA5-sat能够有效的用于枯草芽孢杆菌的改造。
[0007] 本发明的技术方案：
[0008] (1)抗性质粒pMA5-sat的构建：
[0009] 以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计 引物，PI:5'-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3'（BamHI) ;P2 :5'-GGCACGCGTTTAGGCGTCAT CCTGTGCTCC-3'（Mlul);扩增条件：94°C预变性，5min，一个循环；94°C变性，lmin，58°C退火， lmin，72°C延伸，30s，35 个循环；72°C，lOmin，一个循环；15°C，lOmin，一个循环。PCR扩增体 系：合成的sat全基因片段DNAlyL，上下游引物各0.5yL，dNTPMix4yL，10XExTaq Buffer5yL，灭菌的双蒸水38yL，ExTaqDNA聚合酶lyL，扩增sat基因，大小为525bp。 将基因sat连接表达载体pMA5,得到重组质粒pMA5-sat，通过转化大肠杆菌感受态转入大 肠杆菌E.coliJM109中，在含氨苄霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证， 并送样至生工测序正确，得到重组菌E.coliJM109/pMA5-sat;
[0010] (2)抗性质粒pMA5_sat转化Bacillus subtilis RF1 :
[0011] 从重组菌E.coliJM109/pMA5-sat中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat，用改 进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌 BacillussubtilisRF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验 证正确，得到重组菌BacillussubtilisRFl/pMA5_sat〇
[0012] (3)表达载体的构建pMA5-sat_zwf :
[0013] 以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisRF1基因组DNA为模板，根据NCBI中 提供的Bacillussubtilis168的zwf基因序列，用Primer5.0软件设计引物P3: AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4 :ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下 游引入酶切位点BamHI和MluI。以BacillussubtilisRF1基因组DNA为模板，克隆出 基因片段。PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段，连接克隆载体pMD-18T，转化E.coli JM109,阳性转化子经酶切验证后，由上海生工生物有限公司测序，并将重组质粒命名为 T-zwf。载体T-zwf和pMA5通过BamHI与Mlul双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片 段，16°C连接过夜后转化E.coliJM109,通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-zwf。再设 计引物P5 :AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6 :ACCGGGTACCTTATATGITCCACCAGTG，并在其上 下游引入酶切位点EcoRV和KpnI。以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子Hpall的基 因片段Hpall-zwf。基因片段Hpall-zwf和载体pMA5_sat通过EcoRV与KpnI双酶切，经 琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16°C连接过夜后转化E.coliJM109,通过酶切验证，最 终得到表达载体pMA5-sat_zwf。
[0014] (4)表达载体pMA5-sat_zwf转化Bacillus subtilis RF1 :
[0015] 从重组菌E.coliJM109/pMA5-sat_zwf中提取构建正确的重组质粒 pMA5-sat-zwf，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受 态枯草芽孢杆菌BacillussubtilisRF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子， 提取质粒酶切验证正确，得到重组菌BacillussubtilisRFl/pMA5-sat_zwf〇
[0016]用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法：
[0017]出发菌株：枯草芽抱杆菌Bacillus subtilisRF1 和Bacillus subtilisRF1/ pMA5-sat-zwf；
[0018] 培养基组成：种子培养基（g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10。发酵罐发酵培养 基（g/L):葡萄糖 40,酵母粉 10,二水合柠檬酸三钠 0. 11，（NH4)2HP046,KH2P045,MgS04 ? 7H20 1.5，ZnS04.7H20 0.03，MnCl2.4H20 0.05，FeS04.7H20 0.02。发酵罐补料培养基（g/L):葡 萄糖 600,酵母粉 10,（NH4)2HP046,KH2P045。
[0019] 发酵罐培养条件：5L发酵罐装液量2L，转速600rpm，用30% (v/v)NH4OH和1M H2S04控制pH为6. 8,温度40°C，采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓度保持 在10-15g/L。用生物传感分析仪（SBA-40C山东，中国）测定发酵液中残余葡萄糖的含量。
[0020] 本发明的有益效果：构建出一种新型的抗性质粒，可用于宿主菌的抗性筛选，为 宿主菌表达外源基因提供了条件。运用抗性质粒在核黄素生产菌Bacillussubtilis RF1中加强表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，有效地增强了细胞内磷酸戊糖途径的通量，为 核黄素的合成提供了充足的前体物和辅酶NADPH供应。对重组菌Bacillussubtilis RFl/pMA5-sat-ZWf进行发酵分析，多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到 12. 01g/L，比原始菌的 9. 22g/L提高了 30. 3%。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1 :抗性质粒pMA5-sat的构建：
[0022] 以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计