专利名称：一种双向诱导表达质粒、其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种双向诱导表达质粒及其构建方法和用途。
背景技术：
从环境元基因组文库中筛选具有催化作用的基因避开了微生物纯培养的限制，该方法具有广阔的应用前景。底物诱导基因表达筛选技术(Substrate-induced gene-expressionscreening, SIGEX)由于使用了高度自动化的流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)，所以具有省时省力、效率高、能筛选到较新颖的基因等优点，其研究也越来越受到重视。SIGEX技术的理论基础是催化基因的表达常常受其底物或者代谢产物的诱导，并常常受各种调节元件的控制。许多细菌的转录调节与宿主菌(E. coli)具有相似的转录调节机制并能在一起工作，这样，通过SIGEX技术可以筛选到各种细菌内的催化操纵子。 SIGEX技术对环境元基因组文库的筛选主要分为建库、预筛选、底物诱导并阳性克隆筛选三个步骤，其中，用于建库机筛选的可诱导表达质粒载体是该技术的核心和基础。现在已有的可诱导表达质粒载体P18GFP包含了一个绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP) 报告基因(Taku Uchiyama 等，naturebiotehnology，23 (1)，88-93，2005)，但是由于核酸是双链结构并能双向表达，所以现有的可诱导表达质粒载体不能完全报告出克隆于该载体上的可诱导表达的基因片段。构建一个可被双向诱导表达的质粒载体，并在克隆位点正向和反向的下游区都设计上一个报告基因，可以使克隆于该载体上正反两个方向可受诱导的基因片段均得到报告，提高SIGEX的筛选效率。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种同时含有绿色荧光蛋白基因和增强型绿色荧光蛋白基因的双向诱导表达质粒。本发明的目的之二是提供上述双向诱导表达质粒的构建方法。本发明的目的之三是提供上述双向诱导表达质粒的用途。本发明的双向诱导表达质粒是一种同时含有绿色荧光蛋白基因和增强型绿色荧光蛋白基因的质粒。本发明采用基因重组的方法，使绿色荧光蛋白基因与增强型绿色荧光蛋白基因置于一个酶切位点两边并分别在各自的启动子的调控下，获得双向诱导表达质粒。在酶切位点处连接可诱导基因，并转化大肠杆菌得到基因工程菌后，接种于培养基，经诱导生长培养后表达。该双向诱导表达质粒作为载体构建某种基因组文库后，可用于底物诱导的基因表达筛选及环境因素诱导基因表达筛选。该双向诱导表达质粒转化的宿主菌可以是大肠杆菌E. coli JM109.E. coli DH5a。
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该质粒转化大肠杆菌后可得到含该双向诱导表达质粒的菌种，该菌种已于2010 年7月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO. 4004，分类命名为大肠埃希氏菌hcherichia coli。保存该双向诱导表达质粒的方法将其转化进入大肠埃希菌hcherichia coli, 于o°c以下保存，或者溶于重蒸水中，于o°c以下保存。本发明提供双向诱导表达质粒，用于SIGEX可以使克隆于该载体上正反两个方向可受诱导的基因片段均得到报告，提高SIGEX的筛选效率。
图1为双向诱导表达质粒pl8BG的示意2为SIGEX技术对环境元基因组文库的筛选流程图3为双向诱导表达质粒P18BG的构建流程图4为流式细胞仪对环境元基因组文库预筛选5为流式细胞仪对经预筛选并诱导后的环境元基因组文库筛选图
具体实施例方式下面通过构建双向诱导表达质粒pl8BG对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。重组质粒pl8BG的构建将gfp及egfp基因重组到pUC18质粒载体上，以使gfp与egfp基因置于一个酶切位点两边并分别在各自的启动子的调控下，获得一种双向诱导表达质粒P18BG。为此，我们利用聚合酶链式反应(PCR)技术从pGFP质粒上扩展得到gfp基因片段，并在其两端设计上BamH I和sph I酶切位点。利用限制性内切酶BamH I和sph I双酶切消化前述得到的 gfp基因片段，并将酶切后所得到的gfp基因片段与经同样酶切的载体质粒PUC18相连，得到重组质粒P18GFP。接着再利用PCR技术从pEGFP质粒上扩增得到egfp基因片段，并在其两端设计上BamH I和Kpn I酶切位点。利用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切消化前述得到的egfp基因片段，并将酶切后所得到的egfp基因片段与经同样酶切的载体质粒 P18GFP相连，得到重组质粒pl8BG。本实施例中涉及的酶切、连接、感受态细胞制备、电击转化等分子生物学方法均参考"Molecular Cloning-Α laboratory Mannual，，ed. by J. Sambrook, Ε. F. Fritsch and Τ. Maniatis, 1989, CSHL Press.本实施例所涉及的研究材料见下表
权利要求
1.一种双向诱导表达质粒载体，其特征是包含绿色荧光蛋白基因与增强型绿色荧光蛋白基因。
2.如权利要求1所述的双向诱导表达质粒的构建方法，其特征是采用基因重组的方法，使绿色荧光蛋白基因和增强型绿色荧光蛋白基因置于一个酶切位点两边并分别在各自的启动子的调控下，获得双向诱导表达质粒。
3.如权利1所述的双向诱导表达质粒的表达方式，其特征是在酶切位点处连接可诱导基因，并转化大肠杆菌得到基因工程菌后，接种于培养基，经诱导生长培养后表达。
4.如权利要求1所述的双向诱导表达质粒在底物诱导基因表达筛选及环境因素诱导基因表达筛选中的用途。
5.一种保存权利要求1所述的双向诱导表达质粒的方法，其特征是将其转化进入大肠埃希菌(Escherichia coli)，于0°C以下保存，或者溶于重蒸水中，于0°C以下保存。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种双向诱导表达质粒及其构建方法和用途。本发明双向诱导表达质粒载体包含绿色荧光蛋白基因与增强型绿色荧光蛋白基因。采用基因重组的方法构建，使绿色荧光蛋白基因和增强型绿色荧光蛋白基因置于一个酶切位点两边并分别在各自的启动子的调控下，获得双向诱导表达质粒。该双向诱导表达质粒用于底物诱导基因表达筛选及环境因素诱导基因表达筛选中。本发明提高了底物诱导基因表达筛选的效率。
文档编号C12N15/63GK102337283SQ20101023925
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者刘庆华, 李旭东, 杨俊仕, 郝纯 申请人:中国科学院成都生物研究所