专利名称：一种凝固型无添加酸乳的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝固型无添加酸乳的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌。
背景技术：
目前在酸乳制品中，主要是以单一菌株或以数株乳杆菌发酵为主，还未见同时使用乳杆菌进行发酵的产品，这些酸乳制品中活菌含量太低，再加上酸乳制品国家标准设定的下限值较低，它所使用菌株的功能性，均以一般益生菌所固有的改善肠内菌群和提高免疫力为主要健康声称，还未见降低牛奶蛋白抗原性的菌株。
发明内容
本发明提供了一种凝固型无添加酸乳的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌，它不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量。本发明采用了以下技术方案一种干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68，其保藏号为 CGMCC No :3567ο本发明还公开了一种凝固型无添加酸乳的制造方法，它包括以下步骤步骤一，制备发酵原液将浓度为80%的鲜奶和果糖液进行调配混合，然后杀菌冷却；步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68、嗜热链球菌Sti^ptococcus thermophilus和保加利亚乳酸杆菌lactobacillus bulgaricus接种到发酵原液中，搅拌；步骤三，然后将步骤二中搅拌后的混合液装到包装杯中发酵凝固为止，最后在放入冷库中进行冷冻保存。本发明步骤三中的混合液在40°C的恒温下发酵凝固。本发明步骤三中冷库的温度在2-7 °C。本发明步骤二中干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68、嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus 禾口保力口利亚乳酸杆菌 lactobacillus bulgaricus 的比例关系为1:2:1。本发明具有以下有益效果本发明的无添加酸乳中含有干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68和干酪乳杆菌干酪亚种，干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，而且可以具有高耐酸性，强繁殖性，并且能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量，另外热量降低一半，保持爽口不腻的口感，满足了糖尿病患者或渴望低热量食品的消费者的需求，在保质期内的活菌数能维持在108CFU/毫升以上， 大大高于现在市场上的商品含量，益生菌在保质期内能保持活菌数在108CFU/毫升以上的高数量级并且能以存活状态到达肠内。
图1为本发明的利用MEGA3. 1生物学软件构建的系统发育树
具体实施例方式本发明为一种干酪乳杆菌，分类名称为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，参据的生物材料(株)JY68，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101， 其保藏编号为CGMCC No. 3567，保藏日期为2010年1月12日，结果是存活。干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68的菌株发酵后的产品其抗原价能减低到发酵前的1/1000，它是通过以下实验制得的一、乳酸菌株蛋白酶活性和肽酶活性试验首先从日本购买4个菌株 lactobacillus casei subsp.casei L—14,Streptococcus lactis subsp. cremoris H—61, Streptococcus lactis subsp. lactis 527 ；Streptococcus thermophilus 510 ；又从 Hansen 公司购买的 4 个菌株 Lactobacillus bulgaricus C2, lactobacillus helveticus Cl, lactobacillus lactis Cl, Streptococcus thermophilus Cl;以及分离自新疆传统发酵乳的 2 个菌株Lactobacillus casei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl 菌株的蛋白酶活性和肽酶活性使用Forin法进行了测定。以对Glu-pNA等8种合成基质及酪蛋白的分解程度作为活性判断指标，发现Lactobacillus casei JY68和Sti^ptococcus diacetylactis Fl菌株有较大的蛋白酶活性和肽酶活性。二、降低β乳球蛋白抗原性试验接着将蛋白酶活性和肽酶活性较高的两个菌株接种至10%的灭菌脱脂乳中，对培养液中β乳球蛋白的抗原性利用ELISA法进行测试。酵液脱苦效果的感官评价试验。三、然后将具有β乳球蛋白抗原性低减效果的2个菌株lactcAacillus casei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl添加到10%脱脂乳蛋白酶水解液中，以0. 04%咖啡因的苦度为对照，对其脱苦效果进行了感官评价试验。通过以上试验，优选出不但具有较强的蛋白酶和肽酶活性，而且可以降低β乳球蛋白抗原性以及其发酵液不呈现苦味的干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68 菌株。干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的分离方法以新疆采取的传统发酵乳分离样品，取ImL上述样品放入灭菌小试管中，接种于IOmL石蕊牛乳培养基中，置于37°C 恒温培养箱中增菌培养至酸化凝固并呈现粉红色时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有IOppm放线菌酮和IOppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中，将其放入厌氧培养罐中，置于 37°C条件下培养48小时，形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，置于37°C 条件下培养M小时，待菌株生长好后，再次划线接种于BL琼脂培养集中，37°C下厌氧培养 48小时，记录观察菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为乳杆菌。将所述乳杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存。干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的鉴定方法一、生理生化鉴定参照伯爵氏细菌鉴定系统，对被试菌体的形态以及生理生化特性进行鉴定，采用梅里埃API 50 CHL鉴定试剂盒对其生理生化特性进行鉴定。二、16S rRNA 序列鉴定1、采用的试剂Taq酶、dNTP、DNAmarker、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB, SDS(购自北京宝杰罗生物科技有限公司)GoldVieW(购自北京塞百盛基因技术有限公司)。
2、PCR引物16S rRNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下Ll :5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，L2 :5， -CGGCTACCTTGTTACGACTT-3，3、菌体培养将送检样品在平板上划线分离，培养M_30h后挑取单菌落接种到 20ml液体培养基中，30°C 200rpm培养20_24h。4、基因组DNA提取基因组DNA提取参照文献。用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA。(1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在37°C下培养Mh ； (2)取1. Oml菌液于1. 5ml离心管中，13，OOOrpm离心2min，弃上清；(3)沉淀重悬于1. Oml 0.85% NaCl中。(4)室温13，OOOrpm离心anin，弃上清；(5)沉淀重悬于550 μ 1 IX TE中； (6)加 17 μ 1 溶菌酶(35mg/ml)，37°C 温育 30min ； (7)加 3 μ 1 蛋白酶 K (20mg/ml)，37°C 温育 30min ； (8)加 30 μ 1 10% SDS, 37°C温育 30min ； (9)加 100 μ 1 5Μ NaCl 充分混勻；(10) 加80 μ 1 CTAB/NaCl溶液，混勻，65°C水浴IOmin ； (11)加等体积(0. 7-0. 8ml)氯仿/异戊醇(24 1)，轻轻振荡混勻；(12)室温，13，OOOrpm离心IOmin ； (13)将上清液转移到一新 1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇05 24 1)轻轻振荡混勻；(14)重复第 12)步；(1 将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇04 1)轻轻振荡混勻；(16)重复第1 步；(17)将上清液转移到一新1. 5ml离心管中，加入0. 6体积异丙醇，混勻后4°C静置30min ;(18)20°C 13，OOOrpm离心7min ； (19)弃上清，加500 μ 1 70%乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)；(20) 40C 15，000印111离心71^11;(21)重复洗盐两次；(22) 倒置离心管，干燥DNA沉淀7min。DNA沉淀溶于100 μ 1 1 X TE缓冲液，-20°C保存备用。5、PCR 扩增反应体系为ΙΟΟμΙ:Taq (5U/ μ 1) 0. 8 μ 1 ； 10 X PCR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ 1 ；dNTP Mixture (2. 5mM/ each) 8 μ 1 ；模板 DNA 2. 5ng ；弓丨物 27F (10 μ mol/L) 2 μ 1，引物 1541R(10 μ mol/L) 2 μ 1 ； ddH20 补足到 100 μ 1。PCR反应条件94°C for4min ；94°C for lmin，58°C for lmin，72°C for lmin30sec, 30cycles ； 72°C for 5min ；4°C save, end。6、电泳检测用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 显色剂为GoldView。7、序列测定纯化后的PCR产物采用ABI3730基因测序仪测序。测序工作由上海生工技术有限公司完成。8、序列分析与系统树的构建采用序列图谱软件Chromas，参照正、反向序列图谱，对序列人工校对。从GenBank 核酸序列数据库中下载戈登氏菌属相关模式菌株的16S rRNA基因序列，与所测的RR和RY 菌株序列一起，用Clustal X软件进行序列比对(alignment)；然后利用MEGA3. 1生物学软件构建系统发育树，采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析，并进行1000次重复的
5Bootstraps统计学检验。三结果与分析1生理生化鉴定结果经生理生化试验初步鉴定，JY68细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，接触酶阴性能在 15°C和45°C条件下生长，能利用葡萄糖和果糖，初步鉴定为干酪乳杆菌(LactcAaciIlus casei)其生理生化特性见表1。表1生理生化特征
生理生化特征试验结果生理生化特征试验结果细胞形态杆状葡萄糖 +革兰氏染色+木糖 -接触酶-果糖 +运动性试验-半乳糖 +15"C+甘露醇 +45"C+麦芽糖 +乳糖W七叶苷 +纤维二糖+硝酸盐还原试验 -松三糖+吲哚试验 -棉籽糖-明胶液化试验 -山梨醇+产H2S试验 -阿拉伯糖-V-P试验 -注+表示阳性；-表示阴性；W表示轻微利用2基于16S rRNA基因的分子生物学鉴定2. 116S rRNA基因测序结果 将JY68菌株的PCR反应产物送至上海生工技术公司测序，测得序列结果见如下序列表
1CTATACATGCMGTCGMCGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACA
61TGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTMCACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATM
121CATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCMGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAM
181GATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA
241TGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACT
301GAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCM
361GTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTT
421GGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCA
481CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTA
541TTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAMGCCCTCGGCTTAAC
601CGAGGAAGCGCATCGGMACTGGGAMCTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATG
661TGTAGCGGTGMATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGMGGCGGCTGTCTGGT
721CTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
781TCCATGCCGTMACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGC
841TMCGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGMACTCAAAGGAATTG
901ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTT
961ACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAAT
1021GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCM
1081CGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCG
1141GTGACAMCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGC
1201TACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCT
1261CTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCMCTCGCCTACACGAAGTCGGAATCG
1321CTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC
1381CGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGA
1441GCCGT2. 2BLAST同源性比较结果将所得16S rRNA测得序列，在NCBI网站中进行同源性搜索，JY68菌株与 Lactobacillus casei 16Sr RNA 相似度高达 100%。从Genbank中选择了菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X软件进行序列比对 (alignment)，然后利用MEGA3. 1生物学软件构建系统发育树，所构建的系统发育树见图1。 JY68与Lactobacillus L. casei Shirota_AB531131 亲缘关系最近，因此，进一步证明，JY68 1Lactobacillus casei。 将其命名为Lactobacillus casei JY680本发明公开了一种凝固型无添加酸乳的制造方法，它包括以下步骤步骤一， 制备发酵原液将浓度为80%的鲜奶和果糖液进行调配混合，然后杀菌冷却；步骤二， 将干酷乳杆菌 Lactobacillus casei JY68、嗜热链球菌 Sti^ptococcus thermophilus 和保加利亚乳酸杆菌lactobacillus bulgaricus接种到发酵原液中，干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68、嗜热链球菌Mi^ptococcus thermophilus和保加利亚乳酸杆 ^lactobacillus bulgaricus的比例关系为1 2 1，最后进行搅拌；步骤三，然后将步骤二中搅拌后的混合液装到包装杯中在40°C的恒温下发酵凝固为止，最后在放入冷库中进行冷冻保存，冷库的温度在2-7。C。
权利要求
1.一种干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68，其保藏号为 CGMCCNo :3567。
2.一种凝固型无添加酸乳的制造方法，它包括以下步骤步骤一，制备发酵原液将浓度为80%的鲜奶和果糖液进行调配混合，然后杀菌冷却；步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68、嗜热链球菌Mi^ptococcus thermophilus和保加利亚乳酸杆菌lactobacillus bulgaricus接种到发酵原液中，搅拌；步骤三，然后将步骤二中搅拌后的混合液装到包装杯中发酵凝固为止，最后在放入冷库中进行冷冻保存。
3.根据权利要求2所述的凝固型无添加酸乳的制造方法，其特征是步骤三中的混合液在40°C的恒温下发酵凝固。
4.根据权利要求2所述的凝固型无添加酸乳的制造方法，其特征是步骤三中冷库的温度在2-7 °C。
5.根据权利要求2所述的凝固型无添加酸乳的制造方法，其特征是步骤二中干酪乳杆菌LactcAaciIlus casei JY68、嗜热链球菌Mi^ptococcus thermophilus和保加利亚乳酸杆菌 lactobacillus bulgaricus 的比例关系为 1 2 1。
全文摘要
本发明公开了一种干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68，其保藏号为CGMCC No3567。本发明还公开了一种凝固型无添加酸乳的制造方法，它包括以下步骤步骤一，制备发酵原液将浓度为80％的鲜奶和果糖液进行调配混合，然后杀菌冷却；步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus和保加利亚乳酸杆菌lactobacillus bulgaricus接种到发酵原液中，搅拌；步骤三，然后将步骤二中搅拌后的混合液装到包装杯中发酵凝固为止，最后在放入冷库中进行冷冻保存。
文档编号C12R1/245GK102382779SQ20101023890
公开日2012年3月21日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者赵景阳 申请人:泰州市科星生物技术有限公司