专利名称：转cry1C基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种鉴别转crylC基因水稻品系T1C-19的 转化体特异性PCR方法及其依赖的转化体特异性序列。
背景技术：
水稻作为世界上超过一半人口的主食，是最重要的粮食作物之一。在过去的半个 多世纪里，水稻育种取得了巨大的成功。水稻的单位产量实现了翻番，部分地方甚至提高至 3倍，这为保障世界粮食安全作出了巨大的贡献。但近十几年来水稻的产量停滞不前，这一 方面是由于在育种技术上没有新的突破以及遗传多样性在栽培品种中的逐步变窄，另一方 面也是因为频繁发生的病虫害以及旱灾等自然灾害使得水稻生产损失惨重。然而，世界人 口的持续增长以及社会经济的快速发展导致对粮食的需求不断增加。针对这些问题，我国学者围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大 重要性状，利用转基因技术这种新兴的育种手段对水稻品种进行全面改良以实现农业的 可持续发展。目前我国已经有多个转基因水稻品系进行了生产性实验，申请生产应用生 物安全证书。其中，华中农业大学研发的转crylAb/crylAc基因水稻华恢1号和Bt汕优 63的生产应用生物安全证书于2009年8月获得了批准(http://www. stee. agri. gov. cn/ biosafety/spxx/P020091127591594596689. pdf，审批编号农基安证字(2009)第 072 号和 第73号)，成为我国首批允许商业化种植的转基因水稻。使用新的Bt基因水稻是延缓昆虫抗性产生，提高Bt水稻使用寿命的一种重 要策略。Tang等人培育了转人工合成的crylC基因的水稻品系Tlc-19(Wei Tang, et al. Development ofinsect-resistant transgenic indica rice with a synthetic cryl C* gene. Mol Breeding. 2006，18 :1-10)，其田间实验表现出了对螟虫的高度抗性，为发 展Bt水稻提供了新的种质资源材料。2006年，该品系获准在湖北省进行环境释放(转 CrylC基因抗虫水稻Tlc-19在湖北省的环境释放安全审批书.农基安审字(2006)第006 号)，2009年获准在湖北省进行生产性实验(转crylC基因抗虫水稻Tlc_19在湖北省的 生产性试验安全审批书·农基安审字(2009)第006号)(http://new. croplab. org/web/ detail jsp ？ i_ = 554)。转crylC基因抗虫水稻Tlc_19在通过生产性试验获得生产应用 安全证书后，将可能成为我国又一个即将在生产上商业化种植的转基因水稻。进行转基因成分检测是对转基因植物进行有效监督管理，保障其健康发展的重要 技术基础。PCR技术是转基因成分检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基 因作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类一、筛选检测，以转基 因通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为 靶标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特 异性检测，以转化体特异性片段为靶标区域。这四类检测方法对转基因作物的品系检测特 异性是逐渐增加的。这四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用 的身份检测方法，这种检测方法甚至能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。目前已经有部分专利和文献报道了我国部分转基因水稻品系的转化体特异性片 段序列，例如谢家建等人于2007年和2008年分别利用TAIL-PCR、genome walking和 LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号的转化体特异性 片段序列，并建立了转化体特异性的检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发 现，还没有任何关于转crylC基因水稻品系Tlc-19的转化体特异性片段序列和转化体特异 性检测方法的文章和专利报道。
发明内容
针对上述领域中的空白，提供了转crylC基因水稻品系Tlc_19的转化体特异性序 列以及鉴别转crylC基因水稻品系Tlc-19的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普 通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转crylC基因水稻品系Tlc_19，以及以Tlc-19为亲本 的水稻品系。转crylC基因水稻品系Tlc_19转化体特异性序列，如Seq ID No. 1所示，其中水 稻基因组序列为l_840bp，转化载体序列位于841-1276bp。转crylC基因水稻品系Tlc_19的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR 反应中的正向引物依据SEQ ID NOl中1-840位序列设计，反向引物依据SEQ ID NOl的 841-1276位序列设计。根据权利要求1所述的PCR检测方法，所述正向引物为Tlc-19-Fl :5 ‘-ATATTCCCCAATCATGGAGC-3，，所述反向引物为Tlc-19-Rl :5 ‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3，。扩增区域为扩增SEQ ID NOl的788-1011位，扩增产物大小为224bp。本发明根据转crylC基因水稻品系Tlc_19的T-DNA边界区域(如图1所示)，采 用TALL-PCR方法得到转crylC基因水稻品系Tlc-19的转化体特异性序列如SEQ ID NOl 所示，经分析对比其中l_840bp为水稻基因组序列，841-1276bp为转化载体序列。该特异性 序列为转crylC基因水稻品系Tlc-19所特有，本领域技术人员根据PCR扩增原理，根据上 述两段基因序列来源分别设计引物进行扩增，可专用于该转crylC基因水稻品系Tlc-19及 以其作为亲本的转基因水稻品系的鉴定。优选本发明根据1-840位序列设计正向引物为Tlc-19-Fl 5 ‘-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3，，根据841-1276位序列设计反向引物为Tlc-19-Rl 5 ‘-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3，。经过实验证明，本发明方法可以用于特异性检测转crylC基因水稻品系Tlc-19， 扩增区域为扩增SEQ ID NOl的788-1011位，扩增产物大小为224bp。本发明提供的转crylC基因水稻品系Tlc-19的转化体特异性序列以及依赖其建 立的转化体特异性PCR方法可作为一种鉴定转基因水稻品系Tlc-19，以及以这个品种为亲 本的转基因水稻品系的有效手段，由于转crylC基因水稻品系Tlc-19在通过生产性试验获 得生产应用安全证书后，将可能成为我国又一个即将在生产上商业化种植的转基因水稻品系。因此本发明为特异性鉴定转crylC基因水稻品系Tlc-19提供了便利，该方法的优点在 于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。
图1转crylC基因水稻品系Tlc_19的转化载体T-DNA区构建图谱图2转crylC基因水稻品系Tlc_19的转化体特异性序列TAIL-PCR扩增图谱M =DNA Marker DL2000,大小依次为 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp ； 1-8 引物AD2 AD6、AD8、AD9和ADll的TAIL-PCR第三级扩增反应产物图3转crylC基因水稻品系Tlc_19转化体特异性PCR检测结果M =DNA Marker DL2000 ；1 空白对照，2-5 4个市场水稻样品，6 转cryIC基因水 稻品系Tlc-19
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如 Sambrook 等的分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。实施例1转crylC基因水稻品系Tlc_19转化体特异性序列的克隆1实验材料1. 1植物材料转基因水稻转crylC基因水稻品系Tlc_19 (华中农业大学研发)，本实验室有保 存，可向公众发放用于实验研究。1. 2酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物 工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公 司合成。1. 3实验仪器PCR iTimiX :Eppendorf Mastercycle gradient (Eppendorf co.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA 电泳分析系统Kodak EDAS 290 (Kodak co.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。2实验方法和过程2. 1水稻基因组DNA提取与检测2. 1. 1水稻基因组DNA的提取取苗期水稻叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公 司)的操作手册，进行水稻材料总DNA的提取。
2. 1. 2水稻基因组DNA检测取5 μ 1提取的DNA溶液，以0. 8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判 断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。2. 2转crylC基因水稻品系Tlc_19转化体特异性序列的分离TAIL-PCR用于扩增已知区域的侧翼序列。根据转crylC基因水稻品系Tlc_19的 T-DNA边界区域(如图1所示)设计三个巢式特异性PCR引物bar-Tl、bar_T2和bar_T3， 依次与8个简并引物AD2 AD6、AD8、AD9和ADll分别组合进行三次PCR扩增，引物序列 见表1。PCR反应条件见表2。表1用于TAIL-PCR扩增的特异性引物和简并引物
权利要求
转crylC基因水稻品系T1c 19的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中采用的正向引物依据SEQ ID NO1中1 840位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的841 1276位序列设计。
2.根据权利要求1所述的PCR检测方法，所述正向引物为 Tlc-19-Fl 5 ‘-ATATTCCCCAATCATGGAGC-3，， 所述反向引物为 Tlc-19-Rl 5 ‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3，。
全文摘要
本发明涉及“转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法”属于生物技术领域。本发明提供了转crylC基因水稻品系T1c-19的转化体特异性序列SEQ ID NO1以及依赖其建立的转化体特异性PCR方法即正向引物依据SEQ ID NO1中1-840位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的841-1276位序列设计。该PCR方法可作为一种鉴定转基因水稻品系T1c-19，以及以这个品种为亲本的转基因水稻品系的有效手段。本发明为特异性鉴定转crylC基因水稻品系T1c-19提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。
文档编号C12Q1/68GK101974618SQ20101023874
公开日2011年2月16日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者彭于发, 谢家建 申请人:中国农业科学院植物保护研究所