专利名称：一种漆酶发酵与分离耦合的系统及方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体地，本发明涉及一种漆酶发酵与分离耦合的系统及方法。
背景技术：
漆酶(苯二醇氧氧化还原酶，EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶能催化O2通过4个电子还原成水，并且伴随着一些酚类底物的氧化。漆酶主要用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解等。正是由于漆酶的广阔的应用前景，近几十年来，漆酶成为生物学、化学和环境科学的研究热点。漆酶首先在高等植物漆树中发现，而后人们通过大量的研究发现漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌、少数细菌和昆虫中。真菌漆酶是漆酶的主要来源，其中栓菌在世界各地分布广泛而且在自然界中表现出优异木材降解能力。作为此类真菌的代表性菌株-变色栓菌(Trametes versicolor)是最早报道的能够产生大量漆酶的真菌之一，而且该真菌漆酶已经被一些国际知名酶制剂公司(如Sigma)商品化，但是目前的价格太高，达不到大规模应用的要求。造成漆酶生产和应用成本高的原因之一就在于其发酵表达水平低，因此， 提高漆酶的产率，降低生产成本成为漆酶生产研究的主要目的。目前采用的策略包括漆酶高产菌株的筛选、漆酶的发酵工艺及其合成调控、漆酶基因的克隆和异源表达等等，其中固定化菌丝体发酵技术不仅可以提高漆酶发酵水平还可以提高漆酶生产强度，是降低漆酶生产成本有效策略之一。这些策略虽然能够在一定程度上提高漆酶发酵水平，但其获得的漆酶发酵液的漆酶蛋白表达水平仍然较低，属于稀溶液体系。正是由于漆酶发酵液中目的产物浓度低的特点，导致漆酶分离纯化操作复杂，进一步增加了其生产成本。漆酶的纯化一般采用的方法为先经过超滤或硫酸铵分级沉淀，再进行柱层析，如DEAE-S印hadexA-50柱层析、DEAE纤维素柱层析、PhenylSepharoseTM疏水柱层析、Sephaex柱层析等，最后用SDS-PAGE鉴定其纯度。上述方法中漆酶的发酵与分离纯化操作是分开进行的，虽然能分离出高纯度的漆酶，但步骤十分繁琐，处理时间长，而且处理量小，而且在漆酶的发酵过程中菌体会分泌蛋白酶进行蛋白的分解，影响漆酶的得率， 因此及时将发酵液中漆酶从反应体系中有选择性的分离出来是提高漆酶发酵水平的有效方法之一。另外，由于漆酶的蛋白质结构中的组氨酸残基含量高，因而使用亲和色谱进行漆酶的蛋白纯化效果可能更佳，目前亲和色谱所用的配基主要有螯合金属离子、染料配基和 Con-A配基，在实际应用时，亲和色谱可以单独使用或与其他分离方法协同使用。
发明内容
本发明为了解决目前漆酶发酵与分离纯化操作分开进行，程序繁琐，发酵与分离存在漆酶表达水平低、分离纯化操作复杂的问题，从而本发明的目的是提供一种漆酶发酵与分离耦合的系统。本发明的另一目的是提供一种漆酶发酵与分离耦合的方法。根据本发明提供的漆酶发酵与分离耦合的系统，其包括鼓泡床反应器1，磁性介质颗粒原位连续分离的装置3和蠕动泵2，其中，鼓泡床反应器1顶部和底部分别通过蠕动泵 2与磁性介质颗粒原位连续分离装置3的进料口 3-2和出料口 3-8相连通；所述鼓泡床反应器1与磁性介质颗粒原位连续分离装置3的体积比为20-40 1 ；固定化产漆酶菌株置于所述鼓泡床反应器1内；所述磁性介质颗粒原位连续分离的装置3内装有表面螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒，其中，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置3，包括一反应器3-4，所述的反应器 3-4有一罐体3-5，罐体3-5顶部有一进料口 3-2，底部有一放料口 3_17及其物料阀3_18 ； 该罐体3-5内中心轴线位置安装一搅拌桨3-3，搅拌桨3-3上部穿过反应器3-4顶部与驱动搅拌桨3-3的搅拌电机3-1相连；还包括一柱塞式原位连续分离系统3-15 ；所述的柱塞式原位连续分离系统3-15包括有一顶部封闭的圆柱形的套筒3-16， 该套筒3-16底部固设于与罐体3-5侧壁的中下部并与反应器3-4相连通，其内嵌套有一圆柱形活塞3-9，其外套设有一环形磁铁3-6 ；所述的套筒3-16筒体的上部设有一出料口 3-8，该出料口 3-8上还设有一液体阀门3-7 ；所述的活塞3-9通过固定轴套3-11与曲柄连杆机构3-13的曲柄连杆3_12相连， 该曲柄连杆3-12穿设于套筒3-16的顶部，并在曲柄连杆机构3-13的作用下带动活塞3_9
往复运动，所述二氧化硅介孔纳米颗粒具有三维蠕虫状介孔孔道，颗粒的粒径为100 400nm,比表面积为400 850m2/g，其中，所述三维蠕虫状介孔孔道的孔径范围为2 30nm， 孔体积范围为0. 823 2. 996m7g。作为上述系统的一种优选，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置3的套筒3-16与反应器3-4的罐体3-5的内夹角的角度范围是45° 70°。作为上述系统的又一种优选，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置3的活塞3-9 与套筒3-16的内壁呈滑道配合间隙。作为上述系统的另一种优选，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置3的曲柄连杆 3-12与套筒3-16的连接处设有密封圈3-10。作为上述系统的一种改进，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置3的曲柄连杆机构3-13由直流电机驱动。所述的直流电动机为可调速电机，其转速为10 20转/分钟。 作为一种优选，所述的直流电动机还与一时间继电器3-14相连接，由时间继电器3-14控制直流电动机作周期间歇性转动。反应器流出液体中夹带的磁性介质颗粒流经环形永磁铁包裹的套筒区域时被吸引向套筒壁靠近并发生凝并，形成磁性介质颗粒层，圆柱形活塞在时间继电器的控制下由直流电动机驱动作周期间歇性往复运动，从而不断的将在套筒中被分离的磁性介质颗粒推回反应器中进行回收或循环使用，实现磁性介质颗粒的原位连续分
1 O作为上述系统的另一种改进，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置3的环形磁铁 3-6为环形永磁铁或电磁线圈。作为一种优选，所述的环形永磁铁3-6的磁场强度为2000 4000奥斯特，套设在套筒3-16的中间部位，该环形磁铁3-6的两极分布在两个环面，且其内环面是S极。作为上述系统的再一种改进，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置3的罐体3-5、 搅拌桨3-3、套筒3-16、圆柱形活塞3-9的材质均为不锈钢、玻璃或塑料。本发明的漆酶发酵与分离耦合的系统中的磁性介质颗粒原位连续分离装置3的具体实现过程如下在柱塞式原位连续分离系统3-15的套筒3-16外部的环形磁铁3_6的磁场存在的条件下，反应器3-4中的反应液体流经套筒3-16，最后，由套筒3-16上部的出料口 3_8流出。被液体携带的磁性介质颗粒与液体的流动方向一致，其流经套筒3-16时受到环形磁铁 3-6的磁场吸引力的作用，其吸引力能够克服流动液体对磁性颗粒的曳力并将流出液体中夹带的磁性介质颗粒吸附住，被吸引的磁性介质颗粒向柱塞式原位连续分离系统3-15的套筒3-16壁靠近发生凝并，形成一个较为紧密的颗粒层，随着时间的延长，颗粒层由薄变厚，一段时间后，形成一定厚度的磁性介质颗粒层。此吸附时间的长短，可根据实际生产的需要由时间继电器3-14设定。而后时间继电器3-14控制的直流电动机被接通电源并转动，直流电动机驱动曲柄连杆系统，并经固定轴套3-11将转动转变为来回往复运动，直流电机在时间继电器3-14 设定的转动周期内转动一周，流出液体中夹带的磁性介质颗粒此过程中反应液体仍沿套筒 3-16壁与活塞之间的空隙流动，并流向出料口 3-8。此后，流经套筒3-16的反应液体中的磁性介质颗粒继续被磁场吸引并在套筒3-16内壁重新形成新的一定厚度的颗粒层。圆柱形活塞3-9在时间继电器3-14的控制下作周期间歇性往复运动，从而不断的将在套筒3-16中被分离的磁性介质颗粒推回反应器3-4中进行回收或循环使用，实现磁性介质颗粒的原位连续分离。根据本发明的系统，所述超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒通过包括以下步骤的方法制备1)在室温、搅拌的条件下，反应体系中依次加入聚醚胺、一元醇、！^e3O4纳米颗粒、 水、正硅酸乙酯，其中，基于1重量份聚醚胺，加入一元醇2 6重量份、Fe3O4纳米颗粒 0. 01 0. 03重量份、水10 15重量份、正硅酸乙酯0. 5 1. 2重量份；2)将步骤1)得到的混合溶液在搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行水解反应，所得沉淀经磁分离、洗涤、并在有氮气保护的条件下干燥；3)将步骤幻得到的产物在400 600°C的氮气气氛下煅烧除去聚醚胺模板，得到具有三维蠕虫状介孔孔道的超顺磁性二氧化硅纳米颗粒。具体地，本发明的制备具有三维蠕虫状介孔孔道的的超顺磁性二氧化硅纳米颗粒是通过α，ω-二氨基表面活性剂聚醚胺为模板调控制备，可包括以下步骤1)采用现有的文献报道的方法(Peng Ζ. G.，Hidajat K.，Uddin M. S.，J. Colloid Interface Sci.，2004，271，277)制备!^e3O4纳米颗粒，经超声使其分散于去离子水中，形成稳定的悬浮液，浓度为1 5% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用；2)在室温(25°C )、搅拌的条件下反应体系中依次加入聚醚胺、一元醇、Fe3O4纳米颗粒、水、正硅酸乙酯(TEOS)，其中，基于1重量份的聚醚胺，加入一元醇2 6重量份；优选地，在200 400转/分的转速下，充分搅拌10 20分钟，然后加入!^e3O4纳米颗粒0. 01 0. 03重量份；在400 600转/分的转速下，充分搅拌20 40分钟后加入水10 15重量份；在600 800转/分的转速下充分搅拌10 30分钟后，将转速调整至1500 2000 转/分，加入正硅酸乙酯(TEOS) 0. 5 1. 2重量份；在1500 2000转/分转速下充分搅拌 5 20分钟；3)将步骤2~)得到的混合溶液在搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行水解反应，搅拌速度100 300转/分，反应温度25 90°C，反应时间20 28 小时，所得沉淀经磁分离后，先后用去离子水和乙醇分别洗涤3 5次，并在有氮气保护的条件下在烘箱中烘干；4)将步骤3)得到的产物在高温400 600°C的氮气气氛下煅烧4 6小时除去聚醚胺模板，升温速率2 5°C /分，得到具有三维蠕虫状介孔孔道的超顺磁性二氧化硅纳米颗粒。所述的α，ω- 二氨基表面活性剂选自H2NCH(CH3) CH2 [OCH2CH (CH3) ]ηΝΗ2，即聚醚胺，可选用的分子量(MW)为MW = 400，MW= 2000或MW = 4000，即聚醚胺D-400，D-2000 和 D-4000。所述的一元醇选自甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或者两者的混合物。根据本发明所述的系统，所述鼓泡床反应器1内所固定的产漆酶菌株为变色栓菌。根据本发明的漆酶发酵与分离耦合的方法，其包括以下步骤1)将固定化产漆酶菌株按10-20% ν/ν的装载量置入鼓泡床反应器1中进行发酵，其中，培养基装液量为65-75% ν/ν，鼓泡床反应器中的总装载量控制在85% ；2)发酵48_60h后，通过蠕动泵2将鼓泡床反应器1中的发酵液导入磁性介质颗粒原位连续分离装置3中进行选择性分离，其中，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置的罐体3-5中装有表面螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒，其浓度为10-20g/L， 吸附发酵液中的漆酶，所述超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒具有三维蠕虫状介孔孔道，颗粒的粒径为100 400nm，比表面积为400 850m2/g，其中，所述三维蠕虫状介孔孔道的孔径范围为2 30nm,孔体积范围为0. 823 2. 996m3/g ；3)分离了漆酶的发酵液从磁性介质颗粒原位连续分离装置3的出料口 3-8在蠕动泵2的作用下返回鼓泡床反应器1中继续发酵；4)发酵结束后，洗脱表面螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒吸附的漆酶，其中，步骤2)和步骤3)中蠕动泵2的流速为每分钟鼓泡床反应器体积的 1/100-200，且两个蠕动泵中料液的流速保持一致。具体地，本发明提供的基于固定化产漆酶菌株和超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体的漆酶发酵与分离耦合的工艺是利用固定化产漆酶菌株的菌丝体在鼓泡床反应器中进行漆酶的发酵，待进入漆酶合成阶段后，采用对漆酶具有高度选择性的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体在磁性介质颗粒原位连续分离装置中对发酵液中的漆酶进行直接捕获分离，不仅能够提高漆酶的发酵水平和生产效率，而且能够极大的简化漆酶生产中发酵与分离的过程。具体地，本发明的方法包括以下步骤
1)将保藏号为CICC 14001的变色栓菌CTrametes versicolor)采用现有文献 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol,2007,23,367)制备以海藻酸钙凝胶为载体的固定化变色栓菌；2)将上述固定化变色栓菌按10-20% (ν/ν)的装载量置入鼓泡床反应器1中，培养基装液量65-75% (ν/ν)，鼓泡床反应器中的总装载量控制在85%，培养温度25°C，通气量 0. 1-0. 2vvm, pH 值控制在 4. 0，发酵培养基的组成(g/L) =KH2PO4O. 2，CaCl2 · 2H20 0. 1， MgSO4 · 7H20 0. 05，NH4H2PO4O. 5，FeSO4 · 7H20 0. 035，glucose 2，NH4Cl 0. 267, CuSO4 · 5H20 0. 02 ；3)采用上述提供的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒的制备方法合成孔径为 18. 3nm的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体，采用已有文献报道的方法(Mohapatra S， Pal D, Ghosh SK,Pramanik P. J. Nanosci. Nanotechnol，2007，7，3193)对其进行表面修饰， 使其表面螯合有铜离子后即获得磁性介孔亲和吸附载体；4)将上述螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后，装入上述的磁性介质颗粒原位连续分离装置3的罐体3-5中，载体浓度为10-20g/L ；5)当发酵48_60h后通过蠕动泵2将鼓泡床反应器1中的发酵液导入磁性介质颗粒原位连续分离装置3中进行漆酶的选择性分离，分离得到的漆酶吸附在上述超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体上，从磁性介质颗粒原位连续分离装置3的出料口 3-8流出的液体经蠕动泵2返回至鼓泡塔反应器1内继续进行发酵，该耦合过程一直持续到漆酶发酵结束的72h，通过以上连续的操作实现漆酶发酵与分离过程的耦合；6)漆酶发酵分离耦合结束后，将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的发酵液排出，不再返回鼓泡床反应器1中，在鼓泡床反应器1中加入新鲜培养基继续进行漆酶发酵；7)将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体吸附的漆酶用PH8. O的咪唑缓冲液洗脱，其后，载体经0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液进行再生处理，然后经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后继续参加漆酶发酵与分离耦合反应，漆酶洗脱液经透析、喷雾干燥后可获得高纯度的漆酶产品。综上所述，本发明提供的漆酶发酵与分离耦合的系统与方法具有以下优点1)采用固定化产漆酶菌株，将漆酶发酵与吸附分离相耦合的策略，在漆酶发酵过程中实现漆酶的直接捕获分离，可提高漆酶的发酵水平；2)固定化产漆酶菌株和超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体均可重复使用，进一步提高了漆酶的生产强度，降低了漆酶发酵成本；3)漆酶发酵与分离耦合的策略，改变了传统漆酶生产的模式，操作简单，便于放大，且适合于高纯度漆酶的生产。
图1为实现漆酶发酵与分离耦合的系统示意图；图2为本发明的磁性介质颗粒原位连续分离装置的结构示意图。附图标识1、鼓泡床反应器 2、蠕动泵3、磁性介质颗粒原位连续分离装置
3-1、搅拌电机3-2、进料口3-3、搅拌桨
3-4、反应器3-5、罐体3-6、环形永磁铁
3-7、液体阀门3-8、出料口3-9、圆柱形活塞
3-10、密封圈3-11、固定轴套3-12、曲柄连杆
3-13、曲柄连杆机构3-14、时间继电器3-15、柱塞式原位连续分离系统
3-16、套筒3-17、放料口3-18、物料阀
具体实施例方式实施例1、1、采用现有文献 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol, 2007, 23, 367)将保藏号为 CICC 14001 的变色栓菌 (Trametes versicolor)制备成以海藻酸钙凝胶为载体的固定化变色栓菌；2、将固定化变色栓菌按20% (ν/ν)的装载量置入鼓泡床反应器1中，培养基装液量65% (ν/ν)，培养温度25°C，通气量0.2VVm，pH值控制在4.0 ；发酵培养基的组成(g/L) KH2PO4O. 2，CaCl2 · 2Η20 0. 1，MgSO4 · 7H20 0. 05，NH4H2PO4O. 5，FeSO4 · 7H20 0. 035，glucose 2，NH4Cl 0. 267，CuSO4 · 5H20 0. 02 ；3、制备孔径为18. 3nm的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体，制备方法如下1)采用现有的文献报道的方法(Peng Ζ. G.，Hidajat K.，Uddin M. S.，J. Colloid Interface Sci.，2004，271，277)制备!^e3O4纳米颗粒，经超声使其分散于去离子水中，形成稳定的悬浮液，浓度为1 5% (w/v)，然后放入冰箱中冷藏备用；2)在室温(25°C )、搅拌的条件下反应体系中依次加入聚醚胺、一元醇、Fe3O4纳米颗粒、水、正硅酸乙酯(TEOS)，其中，基于1重量份的聚醚胺，加入一元醇2 6重量份；优选地，在200 400转/分的转速下，充分搅拌10 20分钟，然后加入!^e3O4纳米颗粒0. 01 0. 03重量份；在400 600转/分的转速下，充分搅拌20 40分钟后加入水10 15重量份；在600 800转/分的转速下充分搅拌10 30分钟后，将转速调整至1500 2000 转/分，加入正硅酸乙酯(TEOS) 0. 5 1. 2重量份；在1500 2000转/分转速下充分搅拌 5 20分钟；3)将步骤2~)得到的混合溶液在搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行水解反应，搅拌速度100 300转/分，反应温度25 90°C，反应时间20 28 小时，所得沉淀经磁分离后，先后用去离子水和乙醇分别洗涤3 5次，并在有氮气保护的条件下在烘箱中烘干；4)将步骤3)得到的产物在高温400 600°C的氮气气氛下煅烧4 6小时除去聚醚胺模板，升温速率2 5°C /分，得到具有三维蠕虫状介孔孔道的超顺磁性二氧化硅纳米颗粒。5)制备得到的超顺磁性二氧化硅纳米颗粒对其表面进行修饰，使其表面螯合有铜离子；4、将螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后，装入磁性介质颗粒原位连续分离装置3的罐体3-5中，载体浓度为20g/L;鼓泡床反应器1与磁性介质颗粒原位连续分离装置3的体积比为40 1 ；5、当发酵4 后通过蠕动泵2将鼓泡床反应器1中的发酵液从进料口 3-2导入磁性介质颗粒原位连续分离装置3中进行漆酶的选择性分离，磁性介质颗粒原位连续分离装置3的柱塞式原位连续分离系统3-15的套筒3-16与反应器3-4的罐体3_5的内夹角α 的角度是70°，直流电动机转速为20转/分钟，环形永磁铁6磁场强度3000奥斯特，时间继电器3-14设为停3分钟开3秒，即活塞的运行周期是每停留3分钟运行一个往复运动， 分离条件温度25°C。分离出的漆酶吸附在超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体上，分离后的发酵液利用蠕动泵2经磁性介质颗粒原位连续分离装置3的出料口 3-8流出返回至鼓泡塔反应器1内继续进行发酵，蠕动泵2的流速保持一致且控制在每分钟鼓泡床反应器体积的1/200，该漆酶发酵与分离耦合的过程一直持续到漆酶发酵结束的72h ；6、漆酶发酵分离耦合结束后，将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的发酵液排出，不再返回鼓泡床反应器1中，在鼓泡床反应器1中加入新鲜培养基继续进行漆酶发酵；7、将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体吸附的漆酶用PH8. 0的咪唑缓冲液洗脱，其后，载体经0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液进行再生处理，然后经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后继续参加漆酶发酵与分离耦合反应，漆酶洗脱液经透析、喷雾干燥后可获得高纯度的漆酶产品，最终获得的漆酶总活力较同等条件下发酵与分离分步操作提高40 %，该耦合体系重复运行10次，获得漆酶总活力保持稳定。实施例2、1、采用现有文献 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol, 2007, 23, 367)将保藏号为 CICC 14001 的变色栓菌 (Trametes versicolor)制备成以海藻酸钙凝胶为载体的固定化变色栓菌；2、将固定化变色栓菌按15% (ν/ν)的装载量置入鼓泡床反应器1中，培养基装液量70% (ν/ν)，培养温度25°C，通气量0. 15vvm，pH值控制在4.0 ；发酵培养基的组成同实施例1 ；3、制备孔径为18. 3nm的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体，制备的具体方法同实施例1 ；4、将螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后，装入磁性介质颗粒原位连续分离装置3的罐体3-5中，载体浓度为 15g/L;鼓泡床反应器1与磁性介质颗粒原位连续分离装置3的体积比为30 1 ；5、当发酵54h后通过蠕动泵2将鼓泡床反应器1中的发酵液通过进料口 3_2导入磁性介质颗粒原位连续分离装置3中进行漆酶的选择性分离，磁性介质颗粒原位连续分离装置3的柱塞式原位连续分离系统3-15的套筒3-16与反应器3-4的罐体3_5的内夹角α 的角度是60°，直流电动机转速为10转/分钟，环形永磁铁6磁场强度观00奥斯特，时间继电器3-14设为停5分钟开6秒，即活塞的运行周期是每停留5分钟运行一个往复运动， 反应温度25°C，分离出的漆酶被吸附在超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体上，分离后的发酵液利用蠕动泵2从磁性介质颗粒原位连续分离装置3的出料口 3-8流出返回至鼓泡塔反应器1内继续进行发酵，蠕动泵的流速保持一致且控制在每分钟鼓泡床反应器体积的 1/150，该漆酶发酵与分离耦合的过程一直持续到漆酶发酵结束的72h ；
6、漆酶发酵分离耦合结束后，将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的发酵液排出，不再返回鼓泡床反应器1中，在鼓泡床反应器1中加入新鲜培养基继续进行漆酶发酵；7、将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的载体吸附的漆酶用pH8. 0的咪唑缓冲液洗脱，其后，载体经0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液进行再生处理，然后经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后继续参加漆酶发酵与分离耦合反应，漆酶洗脱液经透析、喷雾干燥后可获得高纯度的漆酶产品，最终获得的漆酶总活力较同等条件下发酵与分离分步操作提高50%，该耦合体系重复运行10次，获得漆酶总活力保持稳定实施例3、1、采用现有文献 艮道的方法(Dominguez A, Gomez J, Lorenzo Μ, Sanroman A. World J. Microbiol. Biotechnol, 2007, 23, 367)将保藏号为 CICC 14001 的变色栓菌 (Trametes versicolor)制备成以海藻酸钙凝胶为载体的固定化变色栓菌；2、将固定化变色栓菌按10% (ν/ν)的装载量置入鼓泡床反应器中，培养基装液量 75% (ν/ν)，培养温度25°C，通气量0. lvvm，pH值控制在4. 0 ；3、制备孔径为18. 3nm的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体，制备的具体方法同实施例1 ；4、将铜离子螯合的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后，装入磁性介质颗粒原位连续分离装置3的罐体3-5中，载体浓度为IOg/ L ；鼓泡床反应器与磁性介质颗粒原位连续分离装置的体积比为20 1 ；5、当发酵4 后通过蠕动泵2将鼓泡床反应器1中的发酵液通过进料口 3-2导入磁性介质颗粒原位连续分离装置3的罐体3-5中进行漆酶的选择性分离，磁性介质颗粒原位连续分离装置3的柱塞式原位连续分离系统3-15的套筒3-16与反应器3-4的罐体3_5 的内夹角α的角度是45°，直流电动机转速为15转/分钟，环形永磁铁6磁场强度3500 奥斯特，时间继电器3-14设为停4分钟开4秒，即活塞的运行周期是每停留4分运行一个往复运动，反应温度25 °C，分离出的漆酶吸附在超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒载体上，分离后的发酵液利用蠕动泵2经磁性介质颗粒原位连续分离装置3的出料口 3-8流出返回至鼓泡塔反应器1内继续进行发酵，蠕动泵2的流速保持一致且控制在每分钟鼓泡床反应器体积的1/100，该漆酶发酵与分离耦合的过程一直持续到漆酶发酵结束的72h ；6、漆酶发酵分离耦合结束后，将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的发酵液排出，不再返回鼓泡床反应器1中，在鼓泡床反应器1中加入新鲜培养基继续进行漆酶发酵；7、将磁性介质颗粒原位连续分离装置3中的载体吸附的漆酶用pH8. 0的咪唑缓冲液洗脱，其后，载体经0. IM EDTA和0. IM CuSO4溶液进行再生处理，然后经乙醇和无菌水先后分别洗涤3次以上后继续参加漆酶发酵与分离耦合反应，漆酶洗脱液经透析、喷雾干燥后可获得高纯度的漆酶产品，最终获得的漆酶总活力较同等条件下发酵与分离分步操作提高45%，该耦合体系重复运行10次，获得漆酶总活力保持稳定。
权利要求
1.一种漆酶发酵与分离耦合的系统，其特征在于，所述系统包括鼓泡床反应器(1)，一磁性介质颗粒原位连续分离的装置(3)和蠕动泵O)，其中，鼓泡床反应器(1)顶部和底部分别通过蠕动泵O)与磁性介质颗粒原位连续分离装置(3)的进料口(3- 和出料口 (3-8)相连通；所述鼓泡床反应器(1)与磁性介质颗粒原位连续分离装置(3)的体积比为20-40 1 ；固定化产漆酶菌株置于所述鼓泡床反应器(1)内；所述磁性介质颗粒原位连续分离的装置(3)内装有表面螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒，其中，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置(3)，包括一反应器(3-4)，所述的反应器 (3-4)有一罐体(3-5)，罐体(3-5)顶部有一进料口(3-2)，底部有一放料口 (3-17)及其物料阀(3-18)；该罐体(3-5)内中心轴线位置安装一搅拌桨(3-3)，搅拌桨(3-3)上部穿过反应器(3-4)顶部与驱动搅拌桨(3-3)的搅拌电机(3-1)相连；还包括一柱塞式原位连续分离系统(3-15)；所述的柱塞式原位连续分离系统(3-15)包括有一顶部封闭的圆柱形的套筒(3-16)， 该套筒(3-16)底部固设于与罐体(3-5)侧壁的中下部并与反应器(3-4)相连通，其内嵌套有一圆柱形活塞(3-9)，其外套设有一环形磁铁(3-6)；所述的套筒(3-16)筒体的上部设有一出料口(3-8)，该出料口(3-8)上还设有一液体阀门(3-7)；所述的活塞(3-9)通过固定轴套(3-11)与曲柄连杆机构(3-13)的曲柄连杆(3-12) 相连，该曲柄连杆(3-12)穿设于套筒(3-16)的顶部，并在曲柄连杆机构(3-13)的作用下带动活塞(3-9)往复运动，所述二氧化硅介孔纳米颗粒具有三维蠕虫状介孔孔道，颗粒的粒径为100 400nm，比表面积为400 850m2/g，其中，所述三维蠕虫状介孔孔道的孔径范围为2 30nm，孔体积范围为 0. 823 2. 996m3/go
2.根据权利要求1所述的漆酶发酵与分离耦合的系统，其特征在于，所述的磁性介质颗粒原位连续分离装置(3)的套筒(3-16)与反应器(3-4)的罐体(3-5)的内夹角的角度范围是45° 70°。
3.根据权利要求1所述的漆酶发酵与分离耦合的系统，其特征在于，所述的磁性介质颗粒原位连续分离装置(3)的活塞(3-9)与套筒(3-16)的内壁呈滑道配合间隙。
4.根据权利要求1所述的漆酶发酵与分离耦合的系统，其特征在于，所述的磁性介质颗粒原位连续分离装置(3)的曲柄连杆(3-12)与套筒(3-16)的连接处设有密封圈 (3-10)。
5.根据权利要求1所述的漆酶发酵与分离耦合的系统，其特征在于，所述超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒通过包括以下步骤的方法制备1)在室温、搅拌的条件下，反应体系中依次加入聚醚胺、一元醇、狗304纳米颗粒、水、正硅酸乙酯，其中，基于1重量份聚醚胺，加入一元醇2 6重量份、Fe3O4纳米颗粒0. 01 0. 03重量份、水10 15重量份、正硅酸乙酯0. 5 1. 2重量份；2)将步骤1)得到的混合溶液在搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行水解反应，所得沉淀经磁分离、洗涤、并在有氮气保护的条件下干燥；3)将步骤幻得到的产物在400 600°C的氮气气氛下煅烧除去聚醚胺模板，得到具有三维蠕虫状介孔孔道的超顺磁性二氧化硅纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述的磁性介质颗粒原位连续分离的系统，其特征在于，所述鼓泡床反应器(1)内的产漆酶菌株为变色栓菌。
7.一种漆酶发酵与分离耦合的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)将固定化产漆酶菌株按10-20%ν/ν的装载量置入鼓泡床反应器(1)中进行发酵， 其中，培养基装液量为65-75% ν/ν，鼓泡床反应器中的总装载量控制在85% ；2)发酵48-60h后，通过蠕动泵( 将鼓泡床反应器(1)中的发酵液导入磁性介质颗粒原位连续分离装置(3)中进行选择性分离，其中，所述磁性介质颗粒原位连续分离装置的罐体(3-5)中装有表面螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒，其浓度为 10-20g/L，吸附发酵液中的漆酶，所述超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒具有三维蠕虫状介孔孔道，颗粒的粒径为100 400nm，比表面积为400 850m2/g，其中，所述三维蠕虫状介孔孔道的孔径范围为2 30nm，孔体积范围为0. 823 2. 996m3/g ；3)分离漆酶后的发酵液从磁性介质颗粒原位连续分离装置C3)的出料口(3-8)在蠕动泵O)的作用下返回鼓泡床反应器(1)中继续发酵；4)发酵结束后，洗脱表面螯合有铜离子的超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒吸附的漆酶，其中，步骤2)和步骤3)中蠕动泵(2)的流速为每分钟鼓泡床反应器体积的 1/100-200，且两个蠕动泵中料液的流速保持一致。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述超顺磁性二氧化硅介孔纳米颗粒通过包括以下步骤的方法制备1)在室温、搅拌的条件下，反应体系中依次加入聚醚胺、一元醇、狗304纳米颗粒、水、正硅酸乙酯，其中，基于1重量份聚醚胺，加入一元醇2 6重量份、Fe3O4纳米颗粒0. 01 0. 03重量份、水10 15重量份、正硅酸乙酯0. 5 1. 2重量份；2)将步骤1)得到的混合溶液在搅拌、通入氮气保护、水浴加热和加装回流装置的条件下进行水解反应，所得沉淀经磁分离、洗涤、并在有氮气保护的条件下干燥；3)将步骤幻得到的产物在400 600°C的氮气气氛下煅烧除去聚醚胺模板，得到具有三维蠕虫状介孔孔道的超顺磁性二氧化硅纳米颗粒。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述鼓泡床反应器(1)内所固定的产漆酶菌株为变色栓菌。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域，具体地，本发明涉及一种漆酶发酵与分离耦合的系统及方法。根据本发明提供的漆酶发酵与分离耦合的系统，其包括鼓泡床反应器、磁性介质颗粒原位连续分离的装置和蠕动泵，其中，鼓泡床反应器顶部和底部分别通过蠕动泵与磁性介质颗粒原位连续分离装置的进料口和出料口相连通；根据本发明提供的漆酶发酵与分离耦合的方法，包括将固定化产漆酶菌株置入鼓泡床反应器中进行发酵，通过蠕动泵将发酵液导入磁性介质颗粒原位连续分离装置中进行选择性分离，分离后发酵液在蠕动泵的作用下返回鼓泡床反应器中继续发酵，本发明提供的系统和方法改变了传统漆酶生产的模式，提高发酵和分离的水平，而且操作简单，便于放大。
文档编号C12N9/02GK102337201SQ20101023842
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者刘春朝, 王 锋, 郭晨 申请人:中国科学院过程工程研究所