专利名称：鸭源性冠状病毒m蛋白基因及其克隆方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸭源性冠状病毒M蛋白基因及其克隆方 法与应用。
背景技术：
1937年，冠状病毒(Coronaviruses)首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第 一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其 形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和 核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表 株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。该病毒为有囊 膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的 一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该 病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如 大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界 的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。 1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100%，死亡率可达10 30%。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间 缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因。这使得IB对养 鸡业造成的威胁持续存在。而掌握流行毒株的生物学特性和流行特点是正确使用疫苗的前 提。2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB 疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达 20%以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个 1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成 大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿 大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”， 肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌 及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV 疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工 作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保 藏编号为CGMCC NO. 3842，其专利申请号为201010225577. 4，此为第一次有关家鸭感染IBV 的报道。IBV粒子含有3种特异性蛋白，即核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(M)和纤突蛋白(S) ；S 蛋白位于病毒粒子表面，由等摩尔的Sl和S2两个亚单位组成，S蛋白上有主要的病毒保护性抗原表位，其中的Sl部分可激发中和抗体、凝血抗体，与病毒的组织嗜性有关，同时也是 IBV基因组中变异最大的部分，所以国内的研究长期以来多集中在Sl基因上，而对占病毒 总量40%的M蛋白的研究很少。M蛋白膜外部分的亲水端含有多个糖基化位点，对病毒的 传染性具有决定性的作用，其与病毒的复制、抗感染、诱导白细胞产生干扰素等相关，M 蛋白基因是保守性较高的基因。当前，人们对IBV M蛋白基因的研究尚处于探索阶段。因 此，当前迫切需要深入系统的研究IBV中的M蛋白基因，进而从分子生物学水平上揭示IBV 的流行和变异规律，对于研制开发有效基因工程亚单位蛋白疫苗及防治IB的药物，进而预 防和控制IB的发生与流行有着重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是分离出了一种鸭源性冠状病毒ZZ2004，对其M蛋白基 因进行了分析测序，给出了一种克隆该M蛋白基因的方法，并指出了其用途。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842)的M蛋白基因，其核 苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842)的M蛋白基因，其氨 基酸序列如SEQ ID No. 4所示。上述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因的克隆方法，包括以下步骤(1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5 ‘ -GTCGCTAGAGGAGAATGGTA-3 ‘为上游引 物，以 5 ‘ -ATACGCTTCCGTGCTCTTA-3 ‘为下游引物；(2)通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株膜蛋白基因全长片段， PCR 的扩增条件 94°C，5min ;94°C lmin，53°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环，最后于 72°C延 伸10min，4°C结束反应；(3)然后将膜蛋白基因全长片段与pMDIS-T载体连接。上述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗中的应 用，该M蛋白基因可被克隆到质粒载体或真核表达载体上进一步研制出IBV核酸疫苗及活 载体疫苗对预防IBV将具有重要意义。上述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎药物中的应用， 该M蛋白基因一旦被导入植物，并在植物中表达出活性蛋白，有望研制出转基因植物可食 疫苗，作为禽类饲料添加剂，家禽食用含有该种抗原的转基因植物，将激发肠道免疫系统， 从而产生对IBV的免疫能力。上述鸭源性冠状病毒(Avianinfectious bronchitis virus，IBV)ZZ2004，已 于2010年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该鸭源性冠状病 毒的保藏编号为CGMCC NO. 3842，其中国专利申请号为201010225577. 4。本发明具有积极有益的效果此前尚无有关家鸭感染IBV的报道，本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖 场，本病毒不仅可以引起鸡的大批发病及死亡，还可严重影响家鸭的生长发育，同时引起鸭 的感染和死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更
4广，开展对本病毒株的膜蛋白基因结构研究，对于揭示IBV变异规律，区分不同的血清型， 研制新型IBM疫苗和/或抗IB药物，进而对有效的防控IB起到重要作用。
图1为鸭源性冠状病毒ZZ2004的M基因推导的氨基酸序列同源性比对图谱；图2为鸭源性冠状病毒ZZ2004分离株与参考毒株的M蛋白系统进化树；图3为鸭源性冠状病毒ZZ2004的M基因的扩增结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护内容并不局限于下述具 体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。实施例1鸭源性冠状病毒ZZ2004的M基因的克隆方法(I)PCR引物设计设计如下引物序列上游弓丨物 5' -gtcgctagaggagaatggta-3‘；下游弓丨物 5' -atacgcttccgtgctctta-3‘。(2) ZZ2004株的浓缩方法取ZZ2004株感染的尿囊液用灭菌PBS作1 10稀释，取0. 2ml接种于9日龄的 SPF鸡胚绒毛尿囊腔内，37°C下孵化36 48h，4°C下放置12h后收获鸡胚尿囊液。分别取50ml ZZ2004株感染的SPF鸡胚尿囊液于灭菌的离心管3管，以5000rpm离 心20min ；分别弃沉淀，取上清于另一灭菌的离心管中，12000rpm离心20min ；分别弃沉淀， 取上清液加入50ml的超速离心管，不足的以灭菌PBS补足，40000rpm离心4小时；弃上清 液，取沉淀用Iml灭菌PBS悬浮后_20°C保存备用。(3) ZZ2004 株总 RNA 的提取用DNA/RNA 提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 3. 0)提 取RNA，参照试剂盒说明书进行。(4) ZZ2004株基因片段的RT-PCR扩增①反转录反应在0. 2mlMicrotube管中配制下列混合液(表1)，同时设空白对照。表1模板RNA/引物等的混合液制备 在PCR仪上进行变性、退火反应65°C 5min，4°C保存。离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液(表2)。表2反转录反应液
在PCR仪上按下列反应条件进行反转录反应。 300C IOmin,42°C 30min，95°C 5min，4°C保存。 ②PCR反应
按下列表3中的组成在Microtube管中配制PCR反应液。同时设空白对照, 表3PCR反应液配制
10XPCR Buffer II5uL
dNTP Mixture (IOmM each)2 μ L
上游引物IuL
下游引物IuL
TaKaRa Ex Taq HS (5u/ul)0. 5 μ L
上述反转录反应液4. 5 μ L
RNase Free dH2036 μ L
Total Volume
50 μ L瞬时离心后，置PCR仪上扩增。反应条件为94°C，5min -MV lmin，55°C lmin， 72°C lmin，共35个循环，最后于72°C延伸lOmin，反应产物-20°C保存。(5)基因片段回收从1. 0%琼脂糖凝胶切胶回收不同大小的扩增片段，按TaKaRa公司提供的试剂盒 (TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0)操作说明进行。(6)连接将回收得到的DNA按如下体系(表4)与pMD18-T载体在16°C下连接30min，同时 用不连接外源基因的载体作对照。表4载体连接体系
6 (7)JM109感受态细胞的制备①从37°C培养16h的平板上挑取一个单菌落，接种到3ml LB培养基中，37°C振摇 过夜，次日取菌液Iml接种于100ml LB (A-)培养基中，37°C震摇2 3h，使0D600值达到 0. 3 0. 4 ；②转入预冷的50ml离心管中，冰浴IOmin ；③4°C 4000rpm 离心 lOmin，弃上清；④将离心管倒置于滤纸上lmin，除尽残留的培养液；⑤加入预冷的0. lmol/L CaCl2 10ml，重悬菌体，冰浴30min ；⑥重复步骤③、④；⑦用预冷的0. lmol/L CaCl2 4ml，重悬菌体，(需用于-30°C较长期保存的含有 15%甘油的0. lmol/L CaCl2)，分装0. Iml/管，_80°C保存备用，随时使用时4°C保存备用。(8)转化将连接产物转化JM109感受态细胞，按TaKaRa公司生产的试剂盒说明操作。(9)阳性转化子的筛选与鉴定用无菌牙签挑取Amp+/LB琼脂平板上的单个转化菌落(白色菌落)，按菌落编号顺 序接种于含50ug/mlAmp+/LB液体培养基上；37°C下振荡培养12 16h，用质粒小量提取试剂盒提取质粒并采用测序用通用引 物进行鉴定；(10)质粒提取按宝生物生物工程(大连)有限公司生产的质粒提取试剂盒操作说明进行(11)采用通用引物PCR鉴定阳性克隆按下列组成在0. 2ml Microtube管中配制PCR反应液(表5)，同时设空白对照。表5PCR反应液
7 反应程序95°C，3min-MV lmin, 55°C, 30sec, 72°C 30sec，共 35 个循环，最后于 72°C延伸5min，4°C保存；反应产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。(12)测序使用ABI 377全自动测序仪(上海生工生物工程技术服务有限公司)以 通用引物对插入片段进行序列测定。M基因RT-PCR扩增结果见图3。实施例2ZZ2004毒株M基因推导的氨基酸序列同源性比对用DNAst ar软件将ZZ2004毒株M基因推导的氨基酸序列与GenBank登录的7 个参考毒株比较结果表明ZZ2004毒株M基因氨基酸推导序列与参考毒株同源率分别为 93. 9% 91. 1%;ZZ2004毒株M蛋白与经典毒株Beaudette株比较其变异区域主要集中在 3 16aa，211 222aa两个区域内，其他区域仍存在部分散在的点突变；与同源率最高的 SAIBK株比较，其变异区段主要集中在3 17aa区域，其他区域还有一些散在的点突变，参 见图1。ZZ2004毒株M蛋白的氨基酸序列遗传进化树分析(参见图2)结果表明分离株 ZZ2004M蛋白和国内分离株BJ毒株属同一分支，与BJ毒株的亲缘关系较近，与标准株M41、 Beaudette及ZJ971毒株的亲缘关系较远。
权利要求
一种鸭源性冠状病毒的M蛋白基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种鸭源性冠状病毒的M蛋白基因，其特征在于，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
3.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括以 下步骤(1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5'-GTCGCTAGAGGAGAATGGTA-3‘为上游引物， 以 5 ‘ -ATACGCTTCCGTGCTCTTA-3 ‘为下游引物；(2)通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株膜蛋白基因全长片段，PCR 的扩增条件 94°C，5min ;94°C lmin，53°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环，最后于 72°C延伸 10min，4°C结束反应；(3)然后将膜蛋白基因全长片段与PMD18-T载体连接。
4.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋白 疫苗中的应用。
5.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎药 物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种鸭源性冠状病毒M蛋白基因。其具有SEQ ID No.3、4所示的核苷酸序列和氨基酸序列；其克隆方法为选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5′-GTCGCTAGAGGAGAATGGTA-3′为上游引物，以5′-ATACGCTTCCGTGCTCTTA-3′为下游引物；通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒膜蛋白基因全长片段，再与pMD18-T载体连接。与同类冠状病毒相比，ZZ2004变异的程度较大，感染谱更广，对其膜蛋白基因结构研究，从分子生物学水平上揭示其流行、变异规律，对于研制开发有效基因工程亚单位蛋白疫苗及防治IB的药物，进而预防和控制IB的发生与流行有着重要的意义。
文档编号C12N15/50GK101914553SQ20101023765
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者刘兴友, 刘金华, 姚四新, 张兆沛, 李学斌, 王丽荣, 王宪文, 王自良, 赵坤, 赵淑秋 申请人:河南科技学院