一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和酶工程的技术领域，尤其涉及一种a-L-鼠李糖苷酶基因 的克隆、表达及应用。
【背景技术】
[0002] a-L-鼠李糖苷酶（a-L_rhamnosidase(EC3. 2. 1. 40))属于转化糖苷水解酶 类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷（naringin)、芦丁（rutin)、橘皮苷 (hesperidin)等末端的a-L-鼠李糖基。CAZy(http: //www.cazy.org/)数据库中糖苷 水解酶的分类依据是氨基酸序列的相似性，a-L-鼠李糖苷酶包含在四个糖苷水解酶家族 (glycosidehydrolasefamily，GH)，分别是GH13、GH28、GH78 和GH106。
[0003] a-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橘皮苷酶的主要活性成分，是去除柑桔类果汁苦味 的有效物质。果汁中的苦味物质主要是柚皮苷，该苦味物质被柚苷酶水解的过程共有两步 反应，首先在a-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮苷中的a-1，2糖苷键生成普鲁宁，接 着在0-D-葡萄糖苷酶的作用下，脱去D-葡萄糖生成柚皮素。在果汁酶法脱苦工艺中， a-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键，仅有柚苷酶的另一组份0-D-葡萄糖 苷酶存在时，不能与苦味物质柚皮苷发生水解反应。有研宄报道，对琯溪蜜柚果汁进行脱苦 时，向果汁中以10U/mL加酶量添加a-L-鼠李糖苷酶，置于40°C条件下处理lh，果汁的苦 味就能降低到阈值以下。除了在饮料行业中用来去除柑橘类果汁的苦味，在其他行业也具 有很多潜在的应用价值，如通过水解柚皮苷生产L-鼠李糖和普鲁宁，降低这类化合物的生 产成本；增加酿造酒的香味，改善葡萄汁和饮料的香气成分；切除一些糖苷类药物原料末 端的L-鼠李糖等。
[0004] 由于a-L-鼠李糖苷酶的重要应用价值，越来越多的国内外学者致力于该酶的研 宄开发。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种克隆和表达a-L-鼠李糖苷酶的方法，通过从黑曲霉 JMU-TS528中克隆一种a-L-鼠李糖苷酶基因并导入至毕赤酵母GS115中，以得到一种高效 表达a-L-鼠李糖苷酶的基因工程菌。
[0006] 为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
[0007] 一种编码a-L-鼠李糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。该基因 包含2062bp，最大开放阅读框的碱基数为1968,终止密码子为TAA，3'非编码区共有94bp， 登录号为KC750908. 1。
[0008] 一种a-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。该酶由655个氨基 酸残基组成，其分子量是70.lkDa。
[0009] 一种含有编码a-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒。
[0010] 作为实施例的优选方式，所述的a-L-鼠李糖苷酶基因连接在pPIC9K上。
[0011] 一种含有重组质粒的基因工程菌。
[0012] 作为实施例的优选方式，所述的基因工程菌为生产a-L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母 GS115。
[0013] 一种编码a-L-鼠李糖苷酶的基因的克隆及表达方法，所述方法为将所述 a-L-鼠李糖苷酶的基因进行真核表达。
[0014] 作为实施例的优选方式，所述方法包括以下步骤：
[0015] 步骤一、将所述a-L-鼠李糖苷酶的基因与表达载体pPIC9K连接，连接产物转入 大肠杆菌DH5a中，得到重组表达载体，挑取阳性克隆，测序；提取重组表达载体，经Sail线 性化后，采用电转化法将其导入毕赤酵母GS115中，筛选出阳性克隆进行诱导表达；
[0016] 步骤二、将含有重组表达载体的毕赤酵母GS115接种在YH)培养基中进行活化后， 转入BMGY培养基中继续活化，收集0D600为2. 0-3. 0的菌体，转入到BMMY培养基中，置于 30°C，220rpm摇床进行a-L-鼠李糖苷酶的诱导表达；每隔24h按照体积比0. 5%向诱导 的菌液中补加无菌的甲醇；同时将含有空白载体PPIC9K的菌株作为空白对照；通过电泳分 析，判断有无特异性条带出现。
[0017] -种所述的基因工程菌所制备的a-L-鼠李糖苷酶在食品医药行业的应用，包括 以下应用领域：1)制备普鲁宁；2)果汁脱苦；3)改善葡萄汁和饮料的香气成分；4)增加酿 造酒的香味；5)提高果汁的抗氧化性。
[0018] 本发明采用上述技术方案后，具有以下有益效果：
[0019] 1.从黑曲霉JMU-TS528中获取了编码a-L-鼠李糖苷酶的基因；
[0020] 2.涉及到a-L-鼠李糖苷酶基因的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其 在毕赤酵母GS115中的表达，并且该重组酶可以水解柚皮苷、橘皮苷、pNPR、杨梅苷和芸香 苷等多种物质，扩大了该酶的在工业中应用范围。
[0021] 3.该方法可以在短时间内获得大量的且不含其他酶酶活性的a-L-鼠李糖苷酶， 降低了a-L-鼠李糖苷酶的生产成本。
【附图说明】
[0022] 图1黑曲霉JMU-TS528菌株a-L-鼠李糖苷酶三级结构预测图；
[0023] 图2为毕赤酵母工程菌GS115诱导产物电泳图，泳道1为marker，泳道泳道2为毕 赤酵母GS115菌株的产物，泳道3为毕赤酵母GS115菌株经甲醇诱导后的产物，泳道4为毕 赤酵母工程菌GS115未经诱导的产物，泳道5为毕赤酵母工程菌GS115经甲醇诱导后的产 物；
[0024] 图3为重组a-L-鼠李糖苷酶的最适作用pH曲线图；
[0025] 图4为重组a-L-鼠李糖苷酶的pH稳定性曲线图；
[0026] 图5为重组a-L-鼠李糖苷酶的最适作用温度曲线图；
[0027] 图6为重组a-L-鼠李糖苷酶的温度稳定性曲线图。
【具体实施方式】
[0028] 实施例一、基因的克隆及表达
[0029] 1 ?主要试剂
[0030] DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAmarker、克隆载体pMD-18T、限制性内切酶（EcoRI、 Xhol和Blnl)、感受态细胞制备试剂盒均购于大连宝生物公司；PCR产物回收试剂盒、酶解 产物回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒等购自上海生工；RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂 盒购于北京全式金。PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；IPTG、氨苄青霉 素、十二烷基硫酸钠（SDS)购自上海生工；其它常规试剂均为化学分析纯。
[0031] 2.质粒和菌株
[0032] 黑曲霉JMU-TS528、大肠杆菌DH5a、毕赤酵母GS115、和pPIC9K为本实验室保存。
[0033] 3?方法
[0034] 3. 1基因的克隆与测序
[0035] 从黑曲霉JMU-TS528中获取总RNA，逆转录成cDNA，通过第一引物对进行PCR扩 增，PCR反应体系如下（20.OyL):依次加入灭菌后的超纯水15. 7yL、10XPCRBuffer 2.0 1^、(1^13(10臟〇1/16&(*)0.41^、上游引物（10 11111〇1/1)0.3 1^、下游引物（10 11111〇1/ L) 0? 3yL、模板cDNA1. 0yL、Tap酶（2. 5U/yL) 0? 3yL。PCR反应条件：94°C预变性 4min， 94°〇变性11^11，541：退火1111111，721：延伸5〇8,30个循环，721：后延伸1〇111111。通过1.0%琼 脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物，并进行割胶回收，标记为L-rha-1。
[0036] 所述的第一引物对：
【主权项】
1. 一种编码a -L-鼠李糖苷酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 不〇
2. -种如权利要求1所述的编码a -L-鼠李糖苷酶的基因所编码的a -L-鼠李糖苷 酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. -种含有权利要求1所述的编码a -L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒。
4. 一种如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述的a -L-鼠李糖苷酶基因连 接在PPIC9K上。
5. -种含有权利要求3或4所述的重组质粒的基因工程菌。
6. -种如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌为生产 a -L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母GS115。
7. -种如权利要求1所述的编码a -L-鼠李糖苷酶的基因的克隆及表达方法，其特征 在于：所述方法为将所述a -L-鼠李糖苷酶的基因进行真核表达。
8. 如权利要求7所述的一种编码a -L-鼠李糖苷酶的基因的克隆及表达方法，其特征 在于：包括以下步骤： 步骤一、将所述a-L-鼠李糖苷酶的基因与表达载体pPIC9K连接，连接产物转入大肠 杆菌DH5a中，得到重组表达载体，挑取阳性克隆，测序；提取重组表达载体，经Sail线性化 后，采用电转化法将其导入毕赤酵母GS115中，筛选出阳性克隆进行诱导表达； 步骤二、将含有重组表达载体的毕赤酵母GS115接种在YH)培养基中进行活化后，转入 BMGY培养基中继续活化，收集0D600为2. 0-3. 0的菌体，转入到BMMY培养基中，置于30°C， 220 rpm摇床进行a -L-鼠李糖苷酶的诱导表达；每隔24 h按照体积比0. 5%向诱导的菌 液中补加无菌的甲醇；同时将含有空白载体PPIC9K的菌株作为空白对照；通过电泳分析， 判断有无特异性条带出现。
9. 一种如权利要求5或6所述的基因工程菌所制备的a -L-鼠李糖苷酶在食品医药行 业的应用，其特征在于：包括以下应用领域：1)制备普鲁宁；2)果汁脱苦；3)改善葡萄汁和 饮料的香气成分；4)增加酿造酒的香味；5)提高果汁的抗氧化性。
【专利摘要】本发明公开了一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆和表达方法，该编码α-L-鼠李糖苷酶的基因从黑曲霉中获得，在毕赤酵母GS115中进行表达，具体是以黑曲霉总RNA为模板，通过RT-PCR和RACE技术克隆α-L-鼠李糖苷酶的cDNA，采用pPIC9K作为表达载体在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。本发明首次公开了毕赤酵母GS115基因工程菌，该菌株在甲醇的诱导下分泌的产物可以水解柚皮苷、橘皮苷、杨梅苷、pNPR及芸香苷。本发明为微生物发酵法生产α-L-鼠李糖苷酶提供了积极的指导作用，可以在较短的时间内获得大量的α-L-鼠李糖苷酶，以满足工业化生产的需要。
【IPC分类】C12G3-06, C12N15-63, C12N15-56, C12N9-24, A23L2-84, C12P19-60, A23L1-29, C12N1-19, A23L2-52
【公开号】CN104531733
【申请号】CN201410834938
【发明人】李利君, 倪辉, 蔡慧农, 张霞, 肖安风, 杨远帆, 杜希萍, 黄高凌, 朱艳冰
【申请人】集美大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月29日