棉纤维发育相关的GhDUF231L1基因克隆与鉴定的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及棉花基因。具体是一个棉纤维特异表达的DUF231家族基因 GhDUF231Ll及其启动子的克隆与功能鉴定。
【背景技术】：
[0002] 棉纤维是已知的纤维素纯度最高的天然资源之一，在世界纺织业中占有重要地 位。虽然合成纤维的出现曾使棉纤维的市场占有率大幅下降，但棉纤维终因有着良好的透 气性、保暖性和吸湿性以及穿着舒适等优点而不可取代。随着高效、快速的纺纱技术的引 入，以及人们保健意识的增强和生活水平的提高，对棉纤维品质的要求愈加迫切。纤维强度 是原棉品质的重要指标，棉纤维次生壁加厚期是棉纤维强度形成的关键时期，纤维素的累 积速率决定了棉纤维的结构和强度。
[0003] 棉花改良的目标是提高棉花产量和品质，利用基因工程培育优质棉品种，是适应 我国现代农业生产，满足人们对棉纺织品不同需求的有效途径之一。虽然传统棉花育种技 术对于我国棉花生产的发展起着重要的作用，但其方法局限于品种间的基因重组，不仅育 种周期长，而且难以解决遗传连锁、多基因性状和杂交不亲和性等问题。现代基因工程技术 可以将优良外源基因导入并整合到棉花基因组中，使棉花获得自身不具备的新性状，并在 其后代植株中得以遗传和表达。这样不仅可以突破物种间的遗传障碍，大跨度地超越物种 间的不亲和性，而且可以创造出人们所需要的新品种，因而大大拓宽了棉花遗传改良的途 径。棉花纤维品质除了受环境因素影响外，主要由棉花基因型决定。棉花纤维发育相关基 因的克隆鉴定，不仅有助于研宄揭示棉花纤维细胞发育及纤维素合成的分子机理，而且可 以充分利用棉花自身资源改良纤维品质，具有重要的理论意义和巨大的潜在经济价值。
[0004] DUF231家族基因编码了 一类含有未知功能结构域（domainofunknown function，DUF)的蛋白。通常情况下，该类基因还含有一个植物特有的保守 的TBL(trichomebirefringencelike)结构域，在该结构域中有一个典型的 ⑶S(glycine-aspartate-serine)基序。研宄证明，这种保守性存在于一些醋化酶/脂酶当 中（Akohetal.，2004;Uptonetal.，1995)。另外，在该类蛋白C端的DUF231结构域中含 有一个高度保守的氨基酸序列DCXHWCLPGXXDXWN，其中的DCXH基序与⑶S基序中的丝氨酸 残基一起形成一个具有催化功能的结构（Bischoffetal.，2010 ;M?lgaardetal.，2004)。
[0005] 目前，在拟南芥中共发现46个该基因家族成员，其中，TBR(trichome birefringence)与它的同源基因TBL3能够与纤维素合成酶基因CESA(cellulose synthase)共表达。抑制拟南芥TBR或TBL3的表达导致表皮毛和茎的次生细胞壁中的结晶 纤维素含量下降，下胚轴中果胶甲基酯化酶活性升高，果胶甲基酯化程度降低，说明DUF231 蛋白可能参与维持拟南芥某些组织器官细胞壁中果胶（尤其是同型半乳糖醛酸聚糖）的 酯化过程中，而这个过程则保证了次生壁中纤维素的正常合成（Bischoffetal.，2010)。 AXY4和其同源基因AXY4L同属于DUF231家族成员，敲除拟南芥中的AXY4,导致植株除了种 子之外，其它组织器官细胞壁中的木葡聚糖完全缺失0-乙酰化修饰，而种子中木葡聚糖的 乙酰化修饰则完全由其同源基因AXY4L来控制。AXY4可能是一种多糖特异性（尤其是木葡 聚糖特异性）的〇-乙酰基转移酶。虽然这种酰基转移酶的活性以及酰基转移的位置目前 还不清楚，但过量表达AXY4不仅增加了木葡聚糖的乙酰化程度，而且能够使木葡聚糖中的 半乳糖残基发生双乙酰化现象，说明AXY4能够将多个乙酰基团加到同一个半乳糖残基上。 另外，AXY4将乙酰基团加在一个特定的位置，而该位置上的乙酰基团则能够通过化学位移 移至其它位置，从而将这个0-乙酰化的初始位点空出，以备后续乙酰化的进行（Gilleet al.，2011)。ESK1 (Eskimol)是DUF231家族的又一成员，定位于木聚糖的合成场所一高尔基 体中。eskl突变体中，次生壁厚度变薄，茎的支撑力减弱。化学方法分析该突变体的细胞壁 组分发现，虽然ESK1的突变并未引起木聚糖链长度以及还原端丰度的变化，但是却使得木 聚糖的乙酰化程度明显下降。进一步对木聚糖的结构进行分析发现，ESK1的突变导致木聚 糖中的木糖残基上2-0-和3-0-乙酰化程度的降低（Yuanetal.，2013)。另外，全基因组 的基因表达比对显示，ESK1表达量的改变导致冷信号途径中的转录因子以及应答基因的转 录水平也随之发生变化，而且eskl突变体增强了拟南芥植株对冷胁迫的耐受，说明ESK1在 拟南芥应对冷胁迫的过程中发挥着调节因子的作用（Xinetal.，2007)。上述研宄表明，目 前拟南芥中已知的DUF231家族成员均参与到了次生壁物质的合成与修饰过程当中，而大 量该家族成员的功能还有待挖掘。特别是该类基因如何参与棉纤维发育的调控，值得研宄 探讨，以揭示该类基因的生物学功能，为棉纤维品质改良提供科学依据。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的在于提供一个新的棉纤维次生壁发育阶段优势表达的DUF231基因 GhDUF231Ll及其启动子，分析揭示该基因功能和启动子活性，探索其对棉纤维发育调控的 分子机制，进而应用该基因改良棉纤维品质，创造棉花优良品种。
[0007] 提取棉花基因组DNA，利用PCR和基因组步移法（TakaraGenomeWalkingKit)分 离克隆了GhDUF231Ll基因及其5' -上游区。序列分析表明，该基因5' -上游区是1. 6kb 的启动子序列，编码区（0RF)由5个外显子组成，其间插入了 4个内含子。其中，第一个内 含子长97bp，插入第146位氨基酸密码子内；第二个内含子长131bp，插入第236位氨基酸 密码子内；第三个内含子长94bp，插入第345位氨基酸密码子内；第四个内含子长85bp，插 入第429与430位氨基酸密码子之间。
[0008] 由于GhDUF231Ll基因在开花后20天（20DPA)的棉纤维中高量表达，因此，我们提 取了 20DPA棉纤维的RNA，反转录成cDNA，继而以20DPA棉纤维cDNA为模板，利用PCR技术 分离鉴定了GhDUF231Ll的cDNA全长序列。GhDUF231Ll的cDNA包含了一个1293bp的开放 阅读框，编码一个含有430氨基酸的蛋白质。该蛋白的N端包含一个跨膜结构域和TBL结 构域，而C端则含有一个典型的DUF231结构域。通过同源进化分析发现，该蛋白与拟南芥 TBL3同源性较高。已有研宄表明，AtTBL3能够调控拟南芥果胶甲基酯化酶的活性，进而影 响次生细胞壁中纤维素的含量，这暗示GhDUF231Ll可能在棉纤维中发挥着类似的功能。
[0009] 对GhDUF231Ll在棉花组织中的表达情况进行了分析，发现该基因在棉纤维细 胞发育早期（1 _ 12DPA)仅有弱的表达，随着纤维细胞进一步发育至次生壁合成期（15 -20DPA)，该基因表达量急剧升高，至20DPA时达到峰值。在棉花其他组织中，该基因不表达 或仅有微弱表达。
[0010] 构建GhDUF231Ll启动子：⑶S基因表达载体，利用⑶S报告基因，在转基因拟南芥 中检测了该启动子的表达活性。分析表明，GhDUF231Ll启动子拟南芥转基因幼苗中有表达 活性，随着植株进一步发育成熟，其GUS表达活性主要集中在植株的维管组织（例如，叶脉 和茎维管系统）中。另外，实验表明，GhDUF231Ll启动子区域含有能够与上游转录因子结 合的顺式作用元件，具有一定的特异表达活性。
[0011] 将GhDUF231Ll:eGFP融合载体转化烟草叶片，培养48小时后，撕取烟草叶片表皮 进行观察发现，GFP绿色荧光信号出现在烟草细胞的细胞膜，表明GhDUF231Ll蛋白可能定 位于细胞膜。
[0012] 构建了GhDUF231Ll基因的过量表达载体，转化拟南芥，获得转基因拟南芥植株， 选取多个后代株系进行表型分析。与野生型相比，过量表达GhDUF231Ll基因的转基因拟南 芥株高明显增加，茎部细胞壁中纤维素含量有所升高，细胞壁中一些单糖组分含量也发生 了显著的变化。以上这些结果表明，GhDUF231Ll参与植物次生细胞壁合成过程的调节，这 暗示该基因在棉纤维细胞次生壁形成过程中可能具有重要调控功能。
[0013] 本发明的优点：
[0014] 1.提供了一个新的棉纤维次生壁发育特异表达的GhDUF231Ll基因（包括启动 子）序列及其cDNA序列。该基因在棉纤维次生壁发育时期高量表达，表明该基因可能在棉 纤维细胞次生壁生物合成中发挥重要的调控作用。分析了该基因启动子在转基因拟南芥维 管组