一种植物种子中调节基因表达的启动子与内含子及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域；本发明涉及植物中基因时空表达的调节。本发明 描述了来自棉花的核苷酸序列，这些核苷酸序列主要包括两个调节元件：启动子和内含子； 利用这些序列来构建植物表达载体，遗传转化植株，调控目标基因在植物种子中的时空表 达。
【背景技术】
[0002] 启动子是基因表达所必需的，其决定了外源基因在转基因植物中表达的空间、时 间和表达的强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。植物基因启动子按其作用方式 大体可以分为三类，即组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。
[0003] 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子。然而，由于组成型启 动子驱动外源基因在受体植物内所有部位持续的表达，不仅造成浪费，而且往往会影响植 株正常的生长发育。
[0004] 组织特异型启动子可将外源基因集中在某一时间和/或目标组织中表达，在这类 启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。 例如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29,豌豆的豆清蛋白基因启动子可在 转化植物种子中特异性表达，马铃薯块茎储藏蛋白基因启动子在块茎中优势表达；水稻胚 乳特异性启动子控制外源基因在水稻胚乳中高效表达等。其不仅避免因在转基因植株非目 标组织中表达所造成的能量浪费，而且可避免因在非收获器官或组织中表达目标蛋白而造 成的转基因食品的潜在的安全性等问题。因此，组织特异性启动子不仅有助于阐明植物形 态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。
[0005] 种子特异型启动子是组织特异型启动子的一种，它可以控制外源基因在植物种子 中高效表达，避免外源基因在植物的其他部位表达，从而减少对植物的不利影响。
[0006] 在基因工程研究中，启动子过强或过弱都有可能影响到基因的表达并对其它基因 的表达产生影响。挑选一个组织特异性强、表达模式与强度适当的启动子往往是基因工程 实验成败的关键。
[0007] 目前，在棉花的遗传转化以及基因功能等研究方面，可利用的种子特异表达启动 子仍较少，开发新型种子特异表达启动子和深入了解这些启动子在结构与功能上的区别将 有助于在基因工程中对基因的表达进行精细调控。
[0008] 此外，在许多植物中都已证实内含子的存在，尤其是当内含子位于转录本5'UTR时，可以显著增强基因的转录效率。在单子叶植物中能够提高基因表达量的内含子有来 自玉米的Adhl、Shi、Bzl、Hsp82、Actin、Ubil和GapAl基因等和来自水稻的SalT、Actl、 OsTubAl和0sCDPK2基因等；在双子叶植物中可以提高表达量的内含子有来自矮牵牛的 RbcS基因和马铃薯的ST-LS1基因等。内含子介导的增强效应可以提高基因表达100倍以 上，一般在2-10倍左右。内含子对基因表达的增强程度与许多因素有关，如内含子自身特 征、启动子和外显子序列特征、细胞类型等。不同内含子对同一基因表达增强的程度不同， 玉米Shi基因的内含子1可以使报告基因表达水平增强40倍，而玉米Adhl基因的内含子 1使报告基因的表达水平仅提高4倍。Adhl基因的内含子2和6均能不同程度地增强报告 基因的表达水平，但内含子9却不能。并且不同内含子对同一基因的表达活性的影响效果 也不相同。
[0009]已有的研究表明，包括陆地棉（G.hirsutum)、海岛棉（G.barbadense)、雷蒙德氏 棉（G.raimondii)以及鲁宾逊氏棉（G.robinsonii)等棉属的FAD2-1基因都含有一个位于 5'UTR的内含子。FAD2-1的内含子位于翻译起始位点上游-9bp处；在棉花中，FAD2-1的 5'UTR内含子富含AT，并具有典型的自主复制元件（ARS)等，该内含子对所调控基因的时 空表达作用仍有待进一步的研究。
[0010] 因此，在本领域内存在用于分离并鉴定新的种子特异或优势表达启动子及表达调 控元件的需要，以便获得具有不同广度、表达水平和细胞类型表达特异性的启动子等表达 调控元件用于种子特异性与种子偏好性表达。
【发明内容】
[0011] 在本发明中，提供了用于在转基因植物中启动目标基因在植物种子中优势表达的 启动子。在SEQIDNO. 1中给出该启动子的核苷酸序列。
[0012] 在本发明中，提供了用于在转基因植物中增强目标基因在种子中优势表达的表达 元件--棉花FAD2-1的5'UTR内含子。在SEQIDN0. 2中给出该内含子的核苷酸序列。
[0013] 发明还涉及多种植物表达载体，所述核苷酸序列的启动子或内含子与载体结合， 构成重组植物表达载体PBI-FAD2-1，pBI-FAD2-Intron。它们包括本发明的启动子或内含 子序列，这些序列启动及增强目标基因在作物种子中特异性转录或偏好性转录。
[0014] 本发明包含所述宿主为根癌农杆菌。所述启动子或增强子与目标基因融合，转化 到植物细胞、植物组织或植物器官中，并培育成转化植株。
[0015] 所述的目标基因为GUS报告基因。所述的转化植物为拟南芥。
[0016]由本发明提供的用于检测转基因植株⑶S基因的存在的核苷酸引物，这些引物的 实例4,转基因植株的分子检测中给出。
【附图说明】
[0017] 图1为PBI121质粒载体示意图。
[0018] 图2为pBI121-FAD2-l载体示意图。
[0019]图 3 为pBI121-FAD2-l_intron质粒载体不意图。
[0020]图4为对照及转基因植株⑶S基因的RT-PCR检测。M是指Marker，1-7是指转基 因植株；Actin基因为内参基因。
[0021] 图5为对照及转基因植株⑶S染色检测结果。 具体的实施方式
[0022] 实施例1，棉花种子优势表达启动子的获得
[0023] 采用天根生化有限公司植物基因组DNA提取试剂盒，提取棉花品种"新陆早33 号"的基因组DNA。以已报道的棉花FAD2-1基因的5' -UTR内含子序列为基础，利用 hiTAIL-PCR，设计长随机简并引物（AD) :5' -ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A) N(G/C/A)NNNCCAA-3，?三条hiTAIL-PCR引物为：PA(5，-CGGTGCATGCAGGAACCTCACC-3 ')，PB (5' -ACGATGGACTCCAGTCCGGCCACCATGGCTTCTTTCTTCGGGCT-3' )，and PC (5，-GC ATGGCGAAATTCTTCTTCTTCTITCAC-3'）?AC1引物为：5'-ACGATGGACTCCAGAG-3'?PCR产物 胶回收操作步骤按照天根生化公司多功能DNA纯化回收试剂盒的说明进行。参照TaKaRa 公司PMD18-TVector试剂盒的说明将目的片段连接到pMD18-TVector上，并转化大肠杆 菌T0P10,筛选抗Amp菌落，同时进行菌落PCR鉴定，经华大基因公司测序正确后，命名为 PMD-FAD2-1。
[0024] 实施例2,棉花FAD2-1基因的5' -UTR内含子序列的获得
[0025] 采用天根生化有限公司植物基因组DNA提取试剂盒，提取"新陆早33号"的基因组 DNA。以已报道的棉花FAD2-1基因的5' -UTR内含子序列为基础，设计出一对特异性引物 IN-F：CGCGGATCCGGTACATTTCTCTTTAATTTCCT,IN-R：CGCGGATCCGGACACGCAAGAAGCAAAAC(戈丨」 线部位为增加的BamHI酶切位点，酶切位点前加保护碱基）：以"新陆早33号"基因组DNA 为模板进行PCR反应。扩增体系为：10XExPCRBuffer2. 5iiL，2.5mmol/LdNTPMixture 2uL,lOumol/LG-Pl与G-P2 各 1yL，棉花基因组DNA2yL，ExTaq(5U/yL) 0? 25yL， 加双蒸水至 25iiL。扩增条件为 94°C5min，35 个循环（94°Clmin，56°Clmin，72°Clmin)， 72°ClOmin。参照TaKaRa公司pMD18-TVector试剂盒的说明将目的片段连接到pMD18-T Vector上，并转化大肠杆菌T