一种含有能够降解苯并[ghi]苝功能基因的质粒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物学与分子生物学技术领域，具体涉及一种含有能够降解苯并[ghi]花功能基因的质粒。
【背景技术】
[0002]多环芳径(PolycyclicAromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环的有毒有机污染物，具有强烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用。PAHs能通过生物累积及食物链的传递作用对生态环境和人体健康造成极大危害，已引起各国环境科学家的高度重视。对环境中多环芳烃的治理技术主要有物理法、化学法和生物法，其中生物法具有操作简单、运行费用低、无二次污染等优点。一般来说，随着多环芳烃苯环数量的增加，其降解速率降低。低分子量的多环芳烃在环境中能较快被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃，例如芘、荧蒽、苯并[a]芘、苯并[ghi]茈、茚并[l，2，3_cd]芘、苯并[b]荧蒽及苯并[k]荧蒽等则难于降解，较长期存在于环境中。因此，构建多环芳烃高效降解菌来强化降解已成为去除多环芳烃污染的一种重要方法。
[0003]多环芳烃降解质粒是细胞内能够自我复制的双链环状的小分子DNA，能降解芳香族化合物的代谢酶通常是由降解质粒基因编码的。因此，多环芳烃降解质粒上携带了部分的降解基因信息，可通过转化作用连接到宿主细菌中构成重组菌，从而使重组菌表现相应的降解多环芳烃的性能。从多环芳烃降解菌株中提取与纯化得到多环芳烃降解质粒对于构建新的多环芳烃高效降解菌以及提高多环芳烃的降解性能都具有重要的意义。但是，国内外缺少关于多环芳烃降解质粒方面的研宄报道。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种含有能够降解苯并[ghi]茈功能基因的质粒。所述含有降解苯并[ghi]花功能基因的质粒由菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3的菌液经过提取与纯化得到的。提取与纯化含有降解苯并[ghi]茈功能基因的质粒所用的菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3，2013年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所，菌种保藏号为CGMCC N0.8623。
[0005]从菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3中提取与纯化含有降解苯并[ghi]茈功能基因的质粒的具体方案为:
[0006](I)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为 -NH4NO3:1.7g.L-1，KH2PO4:1.0g.L-1，K2HPO4:1.0g.L Λ MgCl2:0.30g.L-1，CaCl2.2H20:0.15g.ΙΛ 微量金属液的组成为:CoCl 2.6H20:55mg.?Λ CuCl2:0.35mg.L Λ H3BO3:11.0mg.ΙΛ MnCl2.4H20:45mg.?Λ Na2MoO4.2H20:5.5mg.?Λ NiCl2.2H20:4.5mg.?ΛZnCl2:4.5mg.L S
[0007](2)在超净工作台中向体积为10mL的锥形瓶中加入6.0mL浓度为lg/L的苯并[ghi]茈丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；
[0008](3)向步骤⑵中的锥形瓶内加入60mL按步骤⑴配制的液体培养基；
[0009](4)在超净工作台中挑取菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3，将其接种至步骤(3)中的锥形瓶中，在温度为25?30°C、转速为100r/min的振荡器中培养20?22天；
[0010](5)将步骤(4)中的菌液转移到容积为15mL的离心管中，在10000r/min条件下离心lOmin，弃去上清液；
[0011](6)向步骤(5)中的离心管中加入1mL pH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液，旋祸振荡5min后再进行超声波振荡15min，在10000r/min条件下离心lOmin，弃去上清液分离出菌体；
[0012](7)向由步骤(6)的离心管中加入7mL溶液A，然后混匀；溶液A的组成为:50mL0.45M 三羟基甲基氨基甲烷-HCl，20mL 0.25M EDTA，20mL 0.9M KCl，1mL 百分比浓度为2.0%的氯化十六烷基三甲胺，pH 8.2 ;然后加入2.2mgN-乙酰胞壁质聚糖水解酶，在O?4°C条件下振荡1min后加入1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55°C条件下水浴振荡lh，在10000r/min条件下离心lOmin，收集上清液；
[0013](8)向由步骤(7)得到的上清液中加入ImL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在O?4°C条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心lOmin，收集上清液；
[0014](9)将由步骤(8)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在10000r/min条件下离心lOmin，倒去离心管中的液体；重复这一过程，直至所有由步骤(8)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化；
[0015](10)向经步骤(9)处理后的离心纯化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的组成为:5mL4.5M盐酸胍，1mL 3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，pH 7.0 ;在O?4°C条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体；
[0016](11)向经步骤(10)处理后的离心纯化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的组成为:40mL 1mM 三羟基甲基氨基甲烷-HCl，30mL 3.0MNaCl，30mL 1.5mM EDTA, pH 8.5 ;在 55°C条件下振荡20min，在lOOOOr/min条件下离心5min ;将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min条件下离心5min ;离心管中液体即为含有降解苯并[ghi]茈功能基因的质粒溶液，在_20°C保存备用。
[0017]本发明得到的含有降解苯并[ghi]茈功能基因的质粒可以构建对苯并[ghi]茈具有降解功能的菌株，提高以苯并[ghi]茈为代表的多环芳烃污染物的生物降解效果，对于多环芳烃苯并[ghi]茈污染土壤及水体有应用潜力。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实例进一步说明本发明。
[0019]材料:
[0020](I)菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3，该菌株在2013年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所，菌种保藏号为CGMCC N0.8623。
[0021](2)大肠杆菌BL21感受态细胞(天津博美科生物技术有限公司)。
[0022](3)苯并[ghi]花(纯度多 99%, Sigma Aldrich)。
[0023](4)丙酮、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、异丙醇。
[0024](5) pH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液。
[0025](6)浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液。
[0026](7)浓度为5.5M的醋酸钾溶液。
[0027](8)溶液A 10mL,其组成为:50mL 0.45M三羟基甲基氨基甲烷-HC1，20mL 0.25MEDTA，20mL 0.9M KCl，1mL百分比浓度为2.0 %的氯化十六烷基三甲胺，pH 8.2。
[0028](9溶液B 100mL，其组成为:5mL 4.5M盐酸胍，1mL 3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，pH 7.0ο
[0029](10)溶液C lOOmL，其组成为:40mL 1mM三羟基甲基氨基甲烷-HCl，30mL 3.0MNaCl，30mL 1.5mM EDTA, pH 8.5。
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