一株具有抑菌活性的致病杆菌菌株SN84及代谢物和其代谢物应用的制作方法

本发明属于具有应用潜力的一种生物防治作用的致病杆菌SN84菌株，该菌株及代谢产物对番茄灰霉具有较好的抑菌活性。

背景技术：

番茄灰霉病是番茄生产中常见且危害较重的病害，由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea )侵染引起，发生非常广泛。灰葡萄孢的寄主范围广泛，可危害番茄、辣椒、茄子、黄瓜等多种作物；该病害除危害田间的作物外，还可危害运输和储藏期间的水果和蔬菜，造成进一步的经济损失。由于对灰葡萄孢的抗性资源很少，生产中主要依靠化学防治的方法，常用的化学杀菌剂包括苯并咪唑类、N-苯基氨基甲酸酯类、二甲酰亚胺类和苯胺基嘧啶类。由于大面积、长时间的使用单一种类的杀菌剂和不合理的施药技术，导致灰葡萄孢对某些常规的杀菌剂产生了抗药性和农药残留，并且愈加严重，导致了严重的经济损失，随着对食品安全的关注，生产中亟需开发高效且低毒的杀菌剂防治病害。

近年来，利用生物防治的方法对番茄灰霉病进行控制得到了较多的研究，通过筛选获得地衣芽孢杆菌、木霉菌和芽孢杆菌对灰葡萄孢的生长具有一定的抑制作用；植物精油、抗真菌蛋白、石榴皮提取物、丁香提取物等多种物质对灰葡萄孢有一定的抑制作用。但是存在的普遍问题是抑制效果较差，大多数的研究处于实验室阶段，投入生产中的产品较少。利用生物防治病害的主要缺点是防治效果较差。生防相关研究主要局限在实验室研究，在生产中缺乏应用。

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和大豆疫霉(Phytophthora sojae)属鞭毛菌亚门（Mastigomycotina）卵菌纲（Oomycetes）病原微生物，在分类、生理生化等方面同真菌具有较大差别，常用的杀菌剂对病害的防治效果较差。

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌侵染引起的一种病害。该病于 1918 年在美国首次发现，迄今已在世界各地的辣椒种植区普遍发生，已成为当今世界各地辣椒种植区的主要病害之一。辣椒疫霉的寄主范围广，除辣椒外，还可侵染茄科的番茄、茄子和葫芦科的黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等。另有文献报道，该菌还可侵染可可树、澳洲坚果属山龙眼（Macasamia）及一些豆科植物。

辣椒疫霉可经雨水、土壤、气流等多种途径传播，危害多种作物。辣椒发病时可造成茎杆坏死、叶部枯萎、果实腐烂、整株萎蔫死亡，导致田间大面积死秧。我国最早在上世纪50年代在江苏发现辣椒疫病，目前该病已危及我国的青海、新疆、上海、浙江、北京、云南、辽宁、甘肃、陕西、贵州、四川、广东等许多省区。并且呈逐年加重趋势，给辣椒的生产造成了严重的损失。为此，国家将选育抗疫病辣椒品种列入“八五”攻关项目，组织多方力量，加大研究力度。由于辣椒疫病是一种土传病害，利用化学药剂对其进行防治，效果甚微，且容易造成土壤和环境污染。因此，利用生物防治病害凸显出其优势。

大豆疫霉根腐病是大豆的毁灭性病害。美国最早发现此病，受害也最为严重。大豆疫霉根腐病在大豆的整个生育期内均可发生。病原菌可侵染植株的根、茎、叶和部分豆荚，在感病品种上造成的损失达 25～50%，环境条件适宜个别高感品种产量损失达100%。被害植株种子的蛋白质含量明显降低。我国每年进口的大豆数量在数千万吨，大豆疫霉随进口大豆传入的风险越来越大。1991 年以前我国尚未报道有大豆疫霉根腐病分布。1991 年沈崇尧等首次报道在我国东北地区发现大豆疫霉。我国 1986 年将大豆疫霉根腐病列为对外植物检疫对象，1992 年被列为“进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录”中第一类病害，1995 年大豆疫霉根腐病又被列为国内植物检疫对象，确定的分布范围只在黑龙江省。1996 年李宝英等报道了大豆疫霉在黑龙江省三江平原的危害情况，引起了国家农业部、动植物检疫局、黑龙江省政府等有关部门的高度重视。大豆疫霉根腐病在我国也有逐渐加重趋势，1994 年发生面积为 10 万亩，1995年为30 万亩，1996 年达到 100 万亩，平均每年以 3 倍的速度扩展。大豆疫霉根腐病是否会在中国主要大豆产区普遍发生，如何有效控制其危害和传播，将是中国大豆生产面临的重要课题。

植物病害生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的技术与方法。昆虫病原线虫杀死寄主以后，肠道中共生的致病杆菌能够分泌多种具有杀菌活性的次生代谢产物，保护死亡的昆虫免遭细菌和真菌的侵染。因此，昆虫病原线虫共生菌是是极具潜力的活性代谢产物开发靶标。

本发明通过在我国东北三省不同地区诱捕土壤中的昆虫病原线虫，分离得到昆虫病原线虫肠道中的共生菌，对共生菌进行发酵培养，测试发酵产物对不同病原菌的抑制作用。获得的来自致病杆菌SN84的发酵液对番茄灰霉、辣椒疫霉及大豆疫霉具有良好的控制效果，在平板抑菌试验中能有有效抑制菌丝的生长，在番茄灰霉病的盆栽试验中有效减轻植株的发病，结果显示该菌株具有较好的应用潜力。

技术实现要素：

本发明的目的是通过分离昆虫病原线虫共生菌和抑菌实验，获得代谢产物具有抑菌活性的致病杆菌菌株SN84，在平板抑菌试验和盆栽药效试验中均具有较好的防治效果，具有很好的应用价值。为防治番茄灰霉病、辣椒疫霉菌病和大豆疫霉菌病提供一种高效、特异性强的生物防治方法。

本发明提供的技术方案如下：

一株具有抑菌活性的细菌，其特征在于该细菌菌株为菌株SN84（Xenorhabdus budapestensis），该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc M2015214。

一种具有抑菌活性的细菌的代谢物，其特征在于该代谢物是由菌株SN84经液体发酵制备的所得。

上述具有抑菌活性的细菌的代谢物，其特征在于代谢物制备过程如下：先于NBTA平板培养基中培养，在28℃恒温培养箱中培养3-5天；然后将SN84的单个菌落接种到试管LB培养基中，28℃，180 rpm摇床中培养24 h，获得试管种；再将试管种以9%的接菌量接种到液体A培养基中，28℃，180 rpm摇床中培养72 h；将发酵液在12000 rpm，4℃的条件下离心10 min，最后用0.22μm的滤菌膜过滤即得。

上述具有抑菌活性的细菌的代谢物，其特征在于代谢物制备中采用的LB液体培养基配方为：胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，余下为蒸馏水，pH为7；A液体培养基配方为：葡萄糖 6.13 g/L、蛋白胨 21.29 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 2.46 g/L、KH₂PO₄ 0.86 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.45 g/L、Na₂SO₄ 1.72 g/L余下为蒸馏水，pH为7.2-7.4。

一种具有抑菌活性的细菌的代谢物的应用，其特征在于，将发酵液分别按0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例加入PDA培养基中后接入番茄灰霉菌，抑制番茄灰霉菌的菌丝生长。

一种具有抑菌活性的细菌的代谢物的应用，其特征在于，将发酵液分别按0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例加入V8培养基中后接入辣椒疫霉或大豆疫霉，抑制辣椒疫霉或大豆疫霉的菌丝生长。

一种具有抑菌活性的细菌的代谢物的应用，其特征在于，将发酵液分别按0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例喷洒于番茄幼苗叶片上，防治番茄灰霉病。

本发明的积极效果：抑菌活性的致病杆菌SN84代谢产物可抑制番茄灰霉、辣椒疫霉和大豆疫霉的菌丝生长，通过向番茄幼苗喷洒的方式，提高幼苗的抗病性，从而保证作物产量。在平板中显著抑制番茄灰霉、辣椒疫霉和大豆疫霉的菌丝生长；在盆栽试验中抑制番茄灰霉病的发生，使作物健康生长。

S菌株Xenorhabdus sp. SN84，已于2015年4月9日保藏在中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc M2015214。

附图说明

图1是向马铃薯琼脂培养基中分别加入不同比例的发酵液制成含药平板，在28℃的条件下培养7-10天后的抑菌效果。

图2是向V8培养基中分别加入不同比例的发酵液制成含药平板，在28℃的条件下培养7-10天后的抑菌效果。

图3是向V8培养基中分别加入不同比例的发酵液制成含药平板，在28℃的条件下培养7-10天后的抑菌效果。

图4是发酵液稀释2%，4%，6%，8%，10%后喷洒番茄植株叶面，24 h后接种病原菌，培养7-15天后的防治效果。

具体实施方式

首先对SN84菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行抑菌活性试验，确定其对番茄灰霉菌的作用。

实施例1：菌株SN84的培养

将保存的SN84菌株划线于平板NBTA培养基中，培养基配方为NBTA培养基，即牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、琼脂15 g/L、NaCl 5 g/L、TTC 0.04 g/L、BTB 0.025 g/L、蒸馏水1 L,pH为7.2-7.4。28℃恒温培养箱中培养3-5天。

实施例2：

将SN84的单个菌落接种到试管LB培养基中（每管装5 mL），LB培养基配方：即胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，蒸馏水1L，pH为7。28℃，180 rpm摇床中培养24 h，获得试管种。

再将试管种接种到250 mL三角瓶（每瓶装40 mL）液体A培养基中， A培养基配方：即葡萄糖 6.13 g/L、蛋白胨 21.29 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、（NH₄）₂SO₄ 2.46 g/L、KH₂PO₄0.86 g/L、K₂HPO₄·3H₂O 1.45 g/L、Na₂SO₄ 1.72 g/L、蒸馏水1 L，pH为7.2-7.4。28℃，180 rpm摇床中培养72 h。

将发酵液在12000 rpm，4℃的条件下离心10 min，最后用0.22μm的滤菌膜过滤后配成不同的倍数进行抑菌药效试验。

实施例3：平板抑菌活性试验（见图1）

将发酵液分别以0%、2%、4%、6%、8%、10%的（mL/mL）比例加入40-45℃的PDA培养基中后定量加入到培养皿中，制成含药平板（PDA培养基配方：马铃薯200 g；葡萄糖20 g；琼脂17 g;蒸馏水1000 mL）。将培养7天的番茄灰霉菌块倒扣于含药平板中，培养条件为28℃。培养7-10天后测量菌落直径，计算抑制率和EC₅₀。

（对照组菌落直径-菌饼直径）-（生长组菌落直径-菌饼直径）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（对照组菌落直径-菌饼直径）

菌落直径为十字交叉法测量；EC₅₀使用EXCEL作图获得的公式计算得到。

从实验结果可看出，随着浓度的升高抑菌效果明显增强，且经过多次重复实验，稳定性良好。

实施例4：平板抑菌活性试验（见图2）

将发酵液分别以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的（mL/mL）比例加入40-45℃的V8培养基中后定量加入到培养皿中，制成含药平板（V8培养基配方：进口V8果汁163 mL；碳酸钙1.63 g；琼脂1.5 g/100 mL;蒸馏水1630 mL）。将培养7天的辣椒疫霉菌菌块倒扣于含药平板中，培养条件为28℃。培养7-10天后测量菌落直径，计算抑制率和EC₅₀。

（对照组菌落直径-菌饼直径）-（生长组菌落直径-菌饼直径）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（对照组菌落直径-菌饼直径）

从实验结果可看出，随着浓度的升高抑菌效果明显增强，且经过多次重复实稳定性良好。

实施例5：平板抑菌活性试验（见图3）

将发酵液分别以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的（mL/mL）比例加入40-45℃的V8培养基中后定量加入到培养皿中，制成含药平板（V8培养基配方：进口V8果汁163 mL；碳酸钙1.63 g；琼脂1.5 g/100 mL;蒸馏水1630 mL）。将培养7天的辣椒疫霉菌菌块倒扣于含药平板中，培养条件为28℃。培养7-10天后测量菌落直径，计算抑制率和EC₅₀。

（对照组菌落直径-菌饼直径）-（生长组菌落直径-菌饼直径）

抑制率（%）=--------------------------------------------------------×100%

（对照组菌落直径-菌饼直径）

从实验结果可看出，随着浓度的升高抑菌效果明显增强，且经过多次重复实稳定性良好。

实施例6：盆栽抑菌活性实验（见图4）

将发酵液分别以0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例喷洒于番茄幼苗叶片，24 h后接种培养7天的番茄灰霉菌，接种后的植物在温室中保湿培养，10-12天后调查发病情况，统计发病程度。

从实验结果可看出，随着稀释浓度的降低，发病程度明显降低，且经多次重复实验，效果稳定。