一种多孢木霉菌菌株HZ‑31及其在生物除草中的应用的制作方法

本申请属于微生物应用于农业植物保护领域，具体地说涉及一种多孢木霉菌菌株HZ-31及其在生物除草中的应用。

背景技术：

随着社会文明的进步和公众健康意识的提高，广泛、长期、大量使用化学除草剂所带来的负面影响亦日益显现，倍受全球关注。一方面，大量化学除草剂的施用带来了环境污染，尤其是长残效除草剂的应用引起了残毒药害、导致下茬作物的减产甚至人畜中毒。目前，全世界已经有100余种化学除草剂在30多个国家被禁用或取消登记。另一方面，过度依赖和长期大量使用单一除草剂，导致了杂草抗药性的产生和发展，使得药效降低、用药量增加、成本提高、也更加重了污染，直接威胁到除草剂的继续使用和农业生产安全。据最新统计，全球已发现244种(142种双子叶，102种单子叶)杂草的447个生物型对22类作用位点的156种化学除草剂产生了抗药性。因此，研制广谱、高效、低毒新型绿色除草剂特别是发展生物除草显得十分迫切。1992年世界环境与发展大会要求“在2000年前全世界生物农药的产量占农药总产量的60％”。就生物除草而言，虽然目前远未达到这一目标，但努力发展生物除草技术已逐渐成为全球的共识。

各国为了响应这一号召，制定了本国的发展战略。美国、欧盟等许多国家，制订了相应的法律法规，严格限制或停止使用一些化学农药，同时大力发展生物农药产业。我国在农业“十三·五”规划中提出了“双减(减化肥和农药)”目标。除草剂在整个农药市场中占比超过50％，因此，要想顺利实现这个目标，必须想办法大幅降低化学除草剂的用量。而发展生物除草剂是替代和减少化学除草剂的使用并有效控制草害、保证农作物稳产高产、保障食品安全和公众健康的重要基础；是减少化学除草剂残留、消除二次污染、改善农业生态、实现环境安全和农业可持续发展的重要途径；是现代有机农业生产的基本要求和重要保障。

近10年来，在国家各级政府部门和科研机构的高度重视下，尤其在“十一·五”、“十二·五”和国家“863”项目的资助下，我国已初步建立起了生物除草剂研究的技术体系，以马唐-画眉草弯孢霉C.eragrostidis、稗草-新月弯孢霉Culvularia lunata、稗草-禾长蠕孢菌H.gramineum和蟋蟀草平脐蠕孢菌株B.eleusines、加拿大一枝黄花Solidago canadensis-齐整小核菌S.rolfsii、空心莲子草Alternantera phyloxeroides-假隔链格孢菌Nimbya alternantherae、紫茎泽兰Ageratina adenophora-链格孢菌A.alternata研究已经取得了系列进展，特别是紫茎泽兰致病型链格孢菌代谢产物——4-羟-3-乙酰基吡咯啉-2-酮类化合物作用机理和靶标以及模拟合成的研究具有原创性。目前，已经形成了一批具有自主知识产权的生物除草剂技术成果，申请国家发明专利30余项，其中，国际专利2项；获得中国国家发明授权11项，美国和日本国家发明专利各1项。已经有数项成果进入商业化发展阶段，进行农药注册登记的田间药效，并有望在近期获得正式登记。总之，我国生物除草剂研究正在整体进入一个以追求自主创新为特点的快速发展新阶段。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请针对上述问题，提供了一种多孢木霉菌菌株HZ-31及其在生物除草中的应用。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种多孢木霉菌菌株，其分类命名为多孢木霉HZ-31(Trichoderma polysporum)，该菌株于2016年09月12日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12867。该菌株在PDA平板上培养7d后，表面产生致密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或垫状的疱状物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4个轮生，直角，分生孢子长椭圆形或球形，光滑，结合形态特征和分子鉴定结果，判断菌株HZ-31为多孢木霉(Trichoderma polysporum)。

本发明还公开了一种多孢木霉菌菌株HZ-31的可湿性粉剂。

进一步的，所述粉剂由下列重量百分比的原料组成：高岭土10-15％、聚乙烯醇6％、糊精3％、拉开粉3％、膨润土1％，余量为固体发酵得到的多孢木霉真菌固体发酵物。依次将各组分加入混合机，边加入边搅拌，直至各组分完全混合均匀。

本发明还公开了一种多孢木霉菌菌株HZ-31的可湿性粉剂制备方法，步骤包括：

(1)多孢木霉固体发酵物制备：将多孢木霉菌株HZ-31菌种以40％的量接种于固态基质上，室温下培养8d，粉碎后获得多孢木霉固体发酵物；

(2)各组分依次加入混合机，边加入边搅拌，直至各组分完全混合均匀。

进一步的，所述多孢木霉菌株HZ-31菌种的孢子量1×10⁸个/mL。

本发明还公开了一种用于培养多孢木霉菌株HZ-31菌种的固态基质，所述固态基质由下列重量份数的原料组成：麦麸或麦秆糠96％、小麦粉2％和(NH₄)₂SO₄ 2％，所述基质的含水量为37％。

其培养方法为：该菌采用液体-固体联合发酵的生产方式，即先以液体发酵培养菌丝体，后在固体基质上固定发酵培养，生产真菌侵染的基质。固体培养8d后获得多孢木霉固体发酵物，以高岭土作为载体，聚乙烯醇作为分散剂，膨润土作为稳定剂，糊精作为保护剂，结合拉开粉作为润湿剂，将HZ-31固体发酵物与筛选出的适宜载体、助剂按照15％的载体、6％的分散剂、1％稳定剂和3％的润湿剂的比例混合，粉碎，再混合，制成可湿性粉剂。

生产流程：实验室菌种→一级种子(培养基平板)→液体接种发酵→固体培养基接种→通风晾干→粉碎→干真菌侵染基质→载体助剂→可湿性粉剂→致病性及安全性测定。

本发明还提供一种多孢木霉菌菌株可湿性粉剂在控制野燕麦、酸模叶蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄杂草中的应用。

进一步的，所述可湿性粉剂使用剂量为20g/m²。

本发明的有益技术效果是：

1)本发明利用微生物资源防除杂草具有对作物影响小、环境负效应少、安全性高等优点，符合可持续农业的发展，已受到世界各国的高度重视。对微生物除草剂的评价，理论上主要依据两条标准即有效性(药效)和专一性(安全性)。杂草生防菌具备既对靶标杂草具有强致病性又对作物相对安全两大特点。

2)本发明针对蚕豆、豌豆田的野燕麦、酸模叶蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄等常见杂草，制备一种多孢木霉菌可湿性粉剂，用于生物除草。本发明能有效安全地控制和防治部分农田常见杂草，成本低，无污染，低残留对环境友好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请多孢木霉菌HZ-31可湿性粉剂对野燕麦、酸模叶蓼、密花香薷、薄朔草、藜、萹蓄叶片的离体致病效果；

图2是本申请多孢木霉菌HZ-31可湿性粉剂对藜、野燕麦、密花香薷、萹蓄、薄朔草、酸模叶蓼植株的盆栽活体致病效果；

图3是本申请多孢木霉菌HZ-31可湿性粉剂对藜、密花香薷等田间主要杂草的防控效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种多孢木霉菌菌株，其分类命名为多孢木霉HZ-31(Trichoderma polysporum)，该菌株于2016年09月12日保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12867。该菌株在PDA平板上培养7d后，表面产生致密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或垫状的疱状物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4个轮生，直角，分生孢子长椭圆形或球形，光滑，结合形态特征和分子鉴定结果，判断菌株HZ-31为多孢木霉(Trichoderma polysporum)。

实施例2可湿性粉剂的制备

一、菌株HZ-31最佳发酵条件的确定

以PDA培养基作为基础培养基进行碳氮源单因素试验，以产孢量和孢子悬浮液OD吸光值为指标确定菌株HZ-31最适碳、氮源；选用菜籽饼、麦秆糠、羊粪、麦麸、珍珠岩和蛭石作为基质，接种菌液后培养，确定产孢量高的底物固态发酵基质；以菜籽饼作为底物，混合营养物质加入三角瓶，每个处理加入无菌水20mL，接不同比例基质体积分数的孢子悬浮液，用血球计数板计数确定液体菌种的最适接菌量；通过单因素试验筛选出培养基含水量和培养温度，再结合培养时间这3个量作为因素，分别取5个水平，采用二次正交旋转组合设计进行正交试验，确定该菌的最优培养条件。

结果显示碳氮源、发酵时间、接种量、培养时间等因素对菌株HZ-31的发酵生产均有明显的影响。HZ-31最适碳源为小麦粉，最适氮源(NH4)₂SO₄，在PDA培养基上产孢量达到6.17×10⁸mL^-1时，最适碳源培养基上产孢量达到3.03×10⁹个/mL，最适氮源培养基上产孢量达到7.53×10⁸个/mL。小麦粉和(NH₄)₂SO₄分别作为补充碳氮源，优化了固态培养基，促进了菌株的产孢量。产孢量高的底物固态发酵基质是麦麸或麦秆糠。研究中HZ-31最适宜的接种量为40％。正交试验筛选出该菌株最适培养基质含水量均为37％，最适培养温度为23℃，最佳培养时间为8d。对于菌株HZ-31的发酵生产工艺来说,明确各因素与菌株发酵生产之间的关系,为该菌的规模化生产和剂型研究提供理论依据。

菌株HZ-31可湿性粉剂的制备

(一)载体和助剂的筛选

将高岭土、硅藻土、磷酸钾、拉开粉、几丁质、壳聚糖和羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、膨润土、轻质碳酸钙、聚乙烯醇等载体和助剂，分别按2％的比例加入菌株HZ-31对应的最适培养基。分别以200uL的菌液(稀释106个/mL)涂平板，4-6d之后观察菌落生长状况，确定其对菌株孢子萌发的影响。将8mm的菌饼置于不同载体或助剂的培养基中，观察不同载体助剂对菌株生长状况的影响。

菌落数量及直径测量结果如下：

表1 HZ-31在不同载体上菌落数量及直径记录

由表1看出，载体高岭土处理后，菌落萌发数量多且菌落生长较快，选作HZ-31的载体。聚乙烯醇作为分散剂，膨润土作为稳定剂，糊精作为保护剂，结合拉开粉作为润湿剂。

(二)菌株HZ-31可湿性粉剂制备

采用液体-固体联合发酵的生产方式，即先以液体发酵培养菌丝体，后在固体基质上固定发酵培养，生产真菌侵染的基质。固体培养8d后获得多孢木霉固体发酵物，以高岭土作为载体，聚乙烯醇作为分散剂，膨润土作为稳定剂，糊精作为保护剂，结合拉开粉作为润湿剂，将HZ-31固体发酵物与筛选出的适宜载体、助剂按照15％的载体、6％的分散剂、1％稳定剂和3％的润湿剂的比例混合，粉碎，再混合，制成可湿性粉剂。

实施例3菌株HZ-31可湿性粉剂对杂草的致病性的影响

采集新鲜的杂草叶片，置于垫有无菌滤纸的培养皿中，配置HZ-31可湿性粉剂，接种量为100uL/叶，以只接种清水的叶片为对照，每处理重复三次。置于25℃光照培养箱中保湿培养，观察叶片发病情况。

将田间生长4～5叶期，叶色正常的野燕麦、酸模叶蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄移栽于花盆(Φ＝15cm)中，于实验室内培养；将HZ-31可湿性粉剂溶解后喷雾接种到移栽的健康杂草植株上。以接种清水的植株作为空白对照，设3次重复。接种后的杂草植株置于室温，7d后调查杂草发病程度，称鲜重，计算发病率、鲜重效，所有数据采用DPS统计软件进行差异显著性分析。同时将HZ-31可湿性粉剂溶解后喷雾接种到农田4-6叶期杂草植株上，观察其控制效果。

如图1-3所示，喷施菌株HZ-31可湿性粉剂后，6种杂草均表现出受害症状，不同程度的出现萎蔫，褪绿变黄，甚至枯萎症状。结合发病率、鲜重效综合分析(见表2)，HZ-31可湿性粉剂对野燕麦、酸模叶蓼、密花香薷、萹蓄致病效果突出，HZ-31可作为防除野燕麦、酸模叶蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄等农田杂草的生物除草剂，进行进一步研究。

表2 菌株HZ-31可湿性粉剂对不同杂草致病力

注:同列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

实施例4菌株HZ-1对作物的安全性的影响

将青海省5种主栽作物：春小麦(青春587)、春油菜(青杂5号)、蚕豆(青海9号)、豌豆(草原224)、青稞(北青8号)分别种植于Φ＝15cm花盆中，室内培养备用。HZ-31可湿性粉剂按上述方法接种于到3～4叶期的作物植株上，设3次重复，接种7d后观察供试作物的发病情况，记载发病程度。

HZ-31菌株可湿性粉剂接种后对豌豆(草原224)、蚕豆(青海9号)均无致病性，作物长势和株高与对照植株相比均未受影响，表现为没有反应(NS)；春小麦(青春587)、青稞(北青8号)有轻微的致病性，接种后3d，5％叶片出现萎蔫，后期症状不扩展，表现为轻微反应(LS)；对春油菜(青杂5号)严重感病(SS)。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。