一种提高脐孢木霉菌合成木霉素的方法
【专利摘要】本发明涉及微生物技术和生物防治领域，特别是涉及一种提高脐孢木霉菌（ Trichoderma brevicompactum ）0248合成木霉素的方法。本发明通过获得含潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株AZ1，并在液体发酵培养基中加入潮霉素B，从而提高发酵液中木霉素的浓度。该发明为提高木霉素的发酵单位提供了一种可靠的方法。CGMCC No. 69852012.12.12
【专利说明】一种提高脐孢木霉菌合成木霉素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术和生物防治领域，特别是涉及一种提高脐孢木霉菌iTrichoderma brevicompacturn) 0248 合成木霉素的方法。
【背景技术】
[0002]木霉素(trichodermin)-单端孢霉烯类化合物的一种，该化合物对常见9种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发均有不同程度的抑制作用，对黄瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果，因此被认为是具有广阔生防应用前景的抗真菌物。木霉素主要由木霉属真菌脐孢木霉菌brevicompactum)发療产电。为了提高木霉素的开发价值和市场竞争力，不少研究者采用物理诱变和诱导等方法以期提高木霉素产量，但在现阶段，木霉菌产素水平离工业化进程相距甚远。研究组从大蒜中分离筛选到一株产木霉素的内生真菌-脐孢木霉菌(J.bre vi compac turn ) 0248,也一直致力于提高木霉素发酵单位的研究。
【发明内容】
[0003]在研究提高脐孢木霉菌0248产素水平的试验中发现，一株具有潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化株在含有潮霉素B的培养基中发酵产木霉素的浓度比脐孢木霉菌0248要高。
[0004]本发明通过获得含潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株，并在液体发酵培养基中加入潮霉素B，从而提高发酵液中木霉素的浓度。该发明为提高木霉素的发酵单位提供了一种可靠的方法。
[0005]本发明的目的是针对野生型菌株脐孢木霉菌0248产素水平低的不足，提供一种提高木霉素产素水平的方法；本发明的另一目的是提供了一株高产木霉素的转化菌株。
[0006]本发明所述的脐孢木霉菌0248,分类命名为brevicompactum。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC N0.6985。
[0007]本发明目的通过以下技术方案来实现:
1.以PCAMBIA0380质粒为基础，通过限制性内切酶酶切和T4DNA连接酶连接反应，将pSilent-Ι质粒上的潮霉素B抗性基因连接到pCAMBIA0380质粒的T-DNA区形成新的质粒PCAMBIA0380-H 质粒；
2.通过热激转化，将pCAMBIA0380-H质粒转化至农杆菌AGL-1中，并提取阳性克隆子中质粒，然后通过PCR验证阳性克隆子是否正确；
3.将经PCR验证了的阳性克隆子农杆菌(命名为AP03H)与脐孢木霉菌0248孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至脐孢木霉菌0248中，通过含潮霉素B的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板筛选阳性转化株，获得的阳性转化株(命名为AZ1)；
4.使用含潮霉素B的液体培养基(培养基组成为:牛肉膏10g/L，葡萄糖8 g/L，NaCl2 g/L，潮霉素B 0.1 g/L )培养AZ1，培养条件为:28 °C，180 r/min，振荡培养72 h，发酵液经5000r/min离心lOmin,上清液用于木霉素含量的测定；
5.木霉素的检测
方法:采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5 %苯基甲基硅氧烷为固定液，30 mX320 ymX0.25 μ m);检测器:氢火焰离子检测器(FID);检测器温度270V ;进样口温度250 V ;柱温度:程序升温，初始温度100 °C，保持5 min,以10 V /min升温至260 °C保持5 min ;载气:氮气；流速1.5 mL/min。
[0008]本发明的有益效果:
本发明获得了含有潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株AZ1，该菌株在含潮霉素B的液体培养基中木霉素产量为野生型菌株的6.1倍，显著提高了发酵液中木霉素的浓度，这为木霉素产量的提高提供了一种可靠的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1质粒pCAMBIA0380-H构建流程图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明提高木霉素产量的方法作进一步描述。
[0011]实施例1 (含潮霉素B抗性基因片段质粒的制备)
按以下步骤进行:
(1)使用LB培养基在37 °C，180 r/min的条件下培养pSilent-1及pCAMBIA0380质粒的宿主菌，12 h后采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，分别提取pSilent_l及PCAMBIA0380 质粒。
[0012](2)使用限制性内切酶fciX I和為a I酶，分别对pSilent_l、pCAMBIA0380质粒进行双酶切，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，割取目标条带，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目标条带。
[0013](3)使用T4 DNA连接酶将pSilent-Si质粒上的潮霉素B抗性基因片段(Hygr)连接到pCAMBIA0380质粒的BstX I/Xma I酶切位点，此时的质粒命名为pCAMBIA0380_H。
[0014]实施例2 (农杆菌介导转化)
按以下步骤进行:
(1)将pCAMBIA0380-H质粒转化农杆菌AGL-1感受态细胞中，在YEB培养基中(培养基组成为:蔗糖5 g/L，酵母提取物1 g/L，蛋白胨10 g/L，硫酸镁0.5 g/L) 28°C培养两天后挑取单菌落，并提取质粒，使用潮霉素B抗性基因验证引物H-F/H-R (H-F:GAAGAGGTAAACCCGAAACG, H-R:GGCA AACTGTGA TGGACGAC)进行菌液 PCR，进一步筛选阳性转化子，经验证的农杆菌阳性克隆子命名为AP03H。
[0015](2)将阳性克隆子AP03H菌与脐孢木霉菌0248的孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至0248菌中，通过含潮霉素B (100 μ g/mL)的马铃薯葡萄糖琼脂平板筛选获得阳性转化株(命名为AZ1)；
(3)使用含潮霉素B的液体培养基(培养基组成为:牛肉膏10 g/L，葡萄糖8 g/L，NaCl
2g/L，潮霉素 B 0.1 g/L ),28 °C，180 r/min，振荡培养 72 h，发酵液经 5000r/min 离心lOmin，气相色谱法分别检测脐孢木霉菌0248和转化菌株AZ1中发酵液中木霉素的含量，结果发现AZ1菌发酵液中木霉素浓度为680.39mg/L，而脐孢木霉菌0248菌发酵液中木霉素的浓度为111.54mg/L，提高了约6.1倍。
【权利要求】
1.一种提高脐孢木霉菌合成木霉素的方法，其特征在于首先获得具有潮霉素B抗性基因片段的质粒PCAMBIA0380-H，将pCAMBIA0380_H质粒转化农杆菌AGL-1感受态细胞中，筛选获得农杆菌阳性克隆子(命名为AP03H)，将阳性克隆子AP03H与脐孢木霉菌0248的孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至脐孢木霉菌0248中，通过含潮霉素B的平板筛选获得阳性转化株(命名为AZl);转化株AZl在含有潮霉素B的液体培养基中进行发酵。
2.权利要求1所述的方法，其中脐孢木霉菌brevicompactum),定名为脐孢木霉菌0248，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCCN0.6985ο
【文档编号】C12R1/885GK104342461SQ201410543923
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】申屠旭萍, 袁小枫, 俞晓平, 刘卫平, 汤谷 申请人:中国计量学院