本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种制备纳西肽的方法及其生产菌株。
背景技术：
纳西肽是一类含有多个噻唑环并富含硫元素的肽类抗生素，是一种新型的非吸收性动物饲料添加剂，适合于抑制肠道内革兰氏阳性细菌的生长，肠道给药时，它具有用量低、抑菌范围广、动物体内不残留等特点，可明显促进鸡、猪、鱼等动物的生长。
纳西肽的作用机制为：纳西肽(多硫霉素)在体内和体外均可抑制蛋白质的合成，而不抑制DNA和RNA的合成，这种作用与四环素相似，是通过与23rRNA和核糖体蛋白Lll组成的复合体紧密结合，从而抑制延长因子Tu和G的活性、GTP的水解，最终抑制蛋白质的合成，使细菌的生长受到抑制。
由于国内对纳西肽的研究还不成熟，生产水平远落后于发达国家，因此对纳西肽的生产菌株进行研究，具有重要的经济价值和广阔的市场前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种发酵制备纳西肽的方法。
本发明的另一目的是提供用于发酵制备纳西肽的生产菌株。
为了实现本发明目的，本发明提供一株活跃链霉菌(streptomyces actuosus)BJX004，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.8732，保藏日期2014年1月17日。
活跃链霉菌BJX004在发酵培养基中可以产纳西肽，气生菌丝属于单轮生无螺旋形，末端形成直生孢子链，孢子为圆柱形或椭圆柱形，大小(0.6-0.8μm)×(1.0-1.5μm)，表面光滑，气生菌丝为淡灰色至淡黄灰色，基内菌丝和气生菌丝的颜色无明显区别(黄灰至黄棕色)，在合成培养基或一些有机培养基中产生少量可溶性色素(黄灰至黄棕色)；在酪氨酸琼脂培养基中产生暗黑色色素。
活跃链霉菌BJX004在不同培养基上的生长形态如下：
葡糖天冬素琼脂：为气丝絮状，肉桂褐色，基丝浅黄色至浅洋红色。
甘油天冬素琼脂(ISP)、无机盐淀粉琼脂(ISP)：气丝为灰白色。基丝反面黄色或绿黄色：加0.05N HCl，由黄色变为橙色，可溶色素黄色或微黄色，加0.05N HCl，由黄色变为橙色。
淀粉琼脂：基丝浅黄色。
苹果酸钙琼脂：基丝浅黄色至褐黄色。可溶色素褐黄色。
酵母精麦芽精琼脂(ISP)、燕麦粉琼脂(ISP)：气丝灰色系列，基丝反面黄色或绿黄色，可溶色素微黄色，黄色素遇酸变为橙色。
活跃链霉菌BJX004明胶液化有限，暗褐色素。牛奶不凝固，胨化弱。淀粉水解有限。
本发明还提供一种采用活跃链霉菌BJX004制备纳西肽的方法，包括以下步骤：
1)发酵培养：将所述菌株的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；
2)从发酵液中提取纳西肽。
其中，发酵培养的条件为：35-38℃，200-230rpm(旋转半径为50mm)，振荡培养65-75小时，优选37℃，220rpm，振荡培养72小时。保持发酵环境的相对湿度为50-60％。
发酵培养使用的培养基成分为：KNO30.5-1g/L、(NH4)2S04 0.8-1.5g/L、NaCl 3-5g/L、黄豆粉35-45g/L、酵母粉1-2.5g/L、葡萄糖5-6g/L、淀粉酶0.01-0.02g/L、淀粉40-50g/L和轻质碳酸钙3.5-5g/L，以水(优选蒸馏水)配制。115℃灭菌25min。
培养基成分优选为：KNO30.8g/L、(NH4)2S041g/L、NaCl 4g/L、黄豆粉40g/L、酵母粉2g/L、葡萄糖5.5g/L、淀粉酶0.015g/L、淀粉48g/L和轻质碳酸钙4.5g/L。
发酵过程中种子液的接种量优选为5-10％(体积百分比)，所述种子液为培养至对数生长期的种子液。
用于制备种子液的培养基成分为：黄豆饼粉20g/L、葡萄糖50g/L、玉米浆10g/L、MgSO43g/L、CaCO34g/L，pH6.8，自来水配制。
种子液的培养条件为：35℃，环境相对湿度为50-60％，转速180-200rpm(旋转半径50mm)，培养30小时。
本发明还提供用于PCR检测活跃链霉菌BJX004的特异性引物对，所述引物对为：
正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
反向引物：5′-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA-3′。
本发明提供的活跃链霉菌BJX004发酵生产纳西肽的能力高，可以达到5000μg/mL发酵液，菌株经连续传代5次后其生产纳西肽的能力仍保持原有水平，表明该菌株遗传稳定性好。利用菌株BJX004发酵制备纳西肽的方法，能够提高纳西肽的生产效率，且方法简单易行、成本低廉，适合于纳西肽的大规模工业化生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1菌株的获得
本实施例中采用的高通量初筛方法如下：
发酵阶段：采用96孔深孔板，每孔中装培养基0.3mL。每孔接入菌种，35℃静置培养7天。斜面培养基组成：可溶性淀粉15g/L，牛肉膏3g/L，蛋白冻4g/L，K2HPO40.4g/L，NaCl 0.4g/L，MgSO41g/L，KNO31g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0，蒸馏水配制。
提取阶段：过滤，得到滤液后进行检测。
测定阶段：采用分光光度法。测定步骤如下：
1)标准曲线的绘制
精密称取纳西肽标品5mg，加入0.lmL DMF，溶解后用硼酸混合液制备成lmg/mL的标准液，分别精确量取纳西肽100-800μg(0.1-0.8mL标准液)于8支试管中，用硼酸混合液补充至2mL，每管再加入10mL硼酸缓冲液和8mL水饱和正丁醇，摇匀，37℃水浴静置20min，取上清液4mL加无水乙醇4mL，在波长408nm处比色，读取OD值，绘制标准曲线，并求得曲线方程。
2)发酵液效价的测定
取发酵液5mL于试管中，加入5mL无水乙醇，加塞摇匀，37℃水浴保温45min，过滤，取滤液2mL，加入10mL硼酸缓冲液和8mL水饱和正丁醇溶液，充分摇匀，37℃静置20min，取上清液4mL，加无水乙醇4mL，在波长408nm处比色，读取OD值，将OD值代入标准曲线方程，即得计算结果，单位为μg/ml。
1、从土壤中分离菌株
采集黑龙江省牡丹江市镜泊湖附近土壤，将土壤制成悬浮液，将土壤悬浮液接种于分离培养基中进行培养，挑取单菌落进行稀释划线分离纯化，获得纯培养菌株。
分离培养基由黄豆饼粉20g/L、葡萄糖50g/L、玉米浆10g/L、MgSO43g/L，CaCO34g/L，pH6.8，自来水配制。
初筛：获得的纯培养菌株进行摇瓶发酵培养，发酵结束后，利用分光光度法进行测定，将能产生纳西肽的菌株分别进行如下系列诱 变。
2、诱变
(1)第一轮紫外线诱变
取菌悬液10mL，加入到无菌培养皿中，以30W的紫外照射装置于30cm高处照射。设定照射时间分别为50s、80s。配制分离培养基进行培养，挑取单菌落后，35℃培养7天进行效价测定，获得的高产菌株进行下一步诱变。
(2)第二轮紫外线诱变
对第一轮紫外线诱变获得的高产菌株采用同样的方法再次进行紫外线诱变。获得的高产菌株继续进行化学诱变。
(3)6-氯嘌呤诱变
将菌株斜面接种于无有机氮源的饥饿培养基中，培养过夜，将菌株接种于含有不同浓度的6-氯嘌呤平皿中，6-氯嘌呤的终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL的平皿中。35℃培养7天。挑取单菌落培养，进行效价测定，获得的高产菌株继续诱变。
(4)甲基磺酸乙酯(EMS)诱变
用0.2mol/L，pH6.8的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，加入浓度为0.5mg/mL的EMS于35℃振荡30min后，用生理盐水洗涤孢子3次，涂板挑取单菌落35℃培养7天，挑取单菌落进行高通量初筛、摇瓶复试，筛选获得尼可霉素高产菌株。
(5)NTG诱变
将适量NTG浓溶液加入到一定体积的单孢子悬液中，使其作用浓度达到1.0mg/mL，30℃恒温振摇处理一定时间后，离心收集孢子，并用生理盐水洗涤两次后重新将抱子悬浮于少量的生理盐水中，稀释涂平皿28℃培养4-5天(用过的器皿用1M的NaOH浸泡1天以上或大量水洗)。
6)Co60照射
利用Co60产生的射线对孢子悬液进行诱变处理，照射剂量由照射距离和照射时间进行控制。
经过上述系列方法，最终获得纳西肽高产菌株BJX004。
3、菌株的鉴定
产纳西肽菌株BJX004在发酵培养基中可以产纳西肽，气生菌丝属于单轮生无螺旋形，末端形成直生孢子链，孢子为圆柱形或椭圆柱形，大小(0.6-0.8μm)×(1.0-1.5μm)，表面光滑，气生菌丝为淡灰色至淡黄灰色，基内菌丝和气生菌丝的颜色无明显区别(黄灰至黄棕色)，在合成培养基或一些有机培养基中产生少量可溶性色素(黄灰至黄棕色)；在酪氨酸琼脂培养基中产生暗黑色色素。
通过PCR扩增该菌的16S rDNA，PCR所用的特异性引物对为：
正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID No.2)
反向引物：5′-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA-3′(SEQ ID No.3)；
将PCR产物进行凝胶电泳检测，条带大小为1084bp，切胶回收后对目的条带进行测序，序列如SEQ ID No.1所示。
以上生理生化特征及测序结果表明本实施例中获得的突变菌株为活跃链霉菌(streptomyces actuosus)，将其命名为BJX004。
实施例2发酵活跃链霉菌BJX004生产纳西肽
发酵培养基I组成：KNO30.5g/L、(NH4)2S040.8g/L、NaCl 3g/L、黄豆粉35g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖5g/L、淀粉酶0.01g/L、淀粉40g/L、轻质碳酸钙3.5g/L，以蒸馏水配制。115℃灭菌25min。
发酵培养基Ⅱ组成：KNO31g/L、(NH4)2S041.5g/L、NaCl 5g/L、黄豆粉45g/L、酵母粉2.5g/L、葡萄糖6g/L、淀粉酶0.02g/L、淀粉50g/L、轻质碳酸钙5g/L，以蒸馏水配制。115℃灭菌25min。
发酵培养基Ⅲ组成：KNO30.8g/L、(NH4)2S041g/L、NaCl 4g/L、黄豆粉40g/L、酵母粉2g/L、葡萄糖5.5g/L、淀粉酶0.015g/L、淀粉 48g/L、轻质碳酸钙4.5g/L，以蒸馏水配制。115℃灭菌25min。
1、利用发酵培养基Ⅰ发酵活跃链霉菌BJX004生产纳西肽
(1)斜面培养
将活跃链霉菌BJX004接种到斜面培养基上，在35℃、环境相对湿度为50-60％条件下培养7-8天。
其中，斜面培养基配方为：可溶性淀粉15g/L、牛肉膏3g/L、蛋白膝4g/L、K2HPO40.4g/L、NaCL 0.4g/L、MgSO41g/L、KNO31g/L、琼脂粉15g/L，pH7.0，蒸馏水配制。
(2)种子培养
挖取步骤(1)中得到的斜面菌苔1cm2，将其接入装有30mL灭菌的种子培养基的种子瓶中，在如下条件下培养30小时：35℃，环境相对湿度为50-60％，转速180-200rpm、旋转半径50mm，得到种子培养液。
其中，种子培养基的配方为：黄豆饼粉20g/L、葡萄糖50g/L、玉米浆10g/L、MgSO43g/L、CaCO34g/L，pH6.8，自来水配制。
(3)发酵培养
发酵培养方法：取上述种子培养液按10％(体积百分比)的接种量接种于装有30mL灭菌的发酵培养基Ⅰ的三角瓶中，在如下条件下发酵培养65小时：35℃，环境相对湿度50％，转速200rpm(旋转半径50mm)，得到发酵液。
(4)纳西肽效价检测
实验设4次重复，结果取平均数。得出发酵液效价为4980μg/mL。
2、利用发酵培养基Ⅱ发酵活跃链霉菌BJX004生产纳西肽
(1)斜面培养
同以上步骤(1)
(2)种子培养
同以上步骤(1)
(3)发酵培养
发酵培养方法：取上述种子培养液按5％(体积百分比)的接种量接种于装有30mL灭菌的发酵培养基Ⅱ的瓶中，在如下条件下发酵培养65小时：38℃，环境相对湿度60％，转速200rpm(旋转半径50mm)，得到发酵液。
(4)纳西肽效价检测
实验设4次重复，结果取平均数。得出发酵液效价为5100μg/mL。
3、利用发酵培养基Ⅲ发酵活跃链霉菌BJX004生产纳西肽
(1)斜面培养
同以上步骤(1)
(2)种子培养
同以上步骤(1)
(3)发酵培养
发酵培养方法：取上述种子培养液按8％(体积百分比)的接种量接种于装有30mL灭菌的发酵培养基Ⅲ的瓶中，在如下条件下发酵培养72小时：37℃，环境相对湿度55％，转速220rpm(旋转半径50mm)，得到发酵液。
(4)纳西肽效价检测
实验设4次重复，结果取平均数。得出发酵液效价为5040μg/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。