产耐盐中性纤维素酶的菌株及筛选方法和应用与流程

本发明属于微生物学、酶工程、发酵工程、食品工程及畜牧养殖等领域，具体涉及一种产耐盐中性纤维素酶的海洋菌株及筛选方法及其生产纤维素酶的方法。本发明生产的纤维素酶主要应用于纺织、食品加工及饲料添加剂等行业。

背景技术：

纤维素酶是一种能将纤维素及其衍生物水解成葡萄糖和纤维素二糖等小分子物质的一组酶的总称。一组完整的纤维素酶系通常有相互协同催化水解纤维素的三类酶组成：内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶。内切纤维素酶能作用于纤维素的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键生成带非还原端的较短的寡聚糖；外切纤维素酶能作用于纤维素分子的非还原端水解β-1，4-糖苷键生成纤维二糖；葡萄糖苷酶能将纤维二糖水解成葡萄糖。

根据纤维素酶的应用条件，可以将纤维素酶分为酸性纤维素酶、中性纤维素酶、碱性纤维素酶。由于不同领域的环境不同对纤维素酶的需求也不尽相同，在纺织行业，中性纤维素酶的优势较大。目前国产商品化纤维素酶多为酸性纤维素酶，中性纤维素酶多为国外厂家生产。因此，本领域急需开发新的产高活力的中性纤维素酶菌株。

能产生纤维素酶的微生物主要是真菌和部分细菌。一般真菌产的纤维素酶为酸性纤维素酶且多为胞外酶，酶系组成一般较为复杂，一般会存在多种同工酶。细菌所产的纤维素酶成分较为单一，但是细菌纤维素酶多为中性或碱性胞内酶，多吸附于菌壁，且酶活普遍较低。链霉菌结构简单，有一定的产纤维素能力，是一种较有潜力的纤维素酶生产菌属。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株产耐盐中性纤维素酶的菌株，该菌株已经被中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，分类命名：Streptomyces sp CW，保藏号CCTCC NO:M 2016437，保藏日：2016.8.29。该菌株的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的是提供一株产耐盐中性纤维素酶菌株的筛选方法，通过以下步骤实现：

(1)取少量样品加入到液体富集培养基富集1天后，将经过富集培养后的菌液稀释到10-4，取稀释液涂布于刚果红平板上；

(2)培养5天后，用接种针挑出刚果红平板上产生明显透明圈且不同形态的菌落，转接到刚果红平板上分离单菌落，获得多株菌；

(3)将每株菌株接种于产酶培养基，28℃培养5天，取发酵后的培养基6000rpm离心5分钟获取粗酶液；

(4)实验组将适当稀释的粗酶液0.5mL，含1％CMC-Na的pH6.0的磷酸缓冲液2.0mL混合，空白组不加入粗酶液，于50℃孵育30分钟，实验组再加入2.5mL的DNS溶液，空白组同时再加入相应的粗酶液，混合均匀后沸水浴5分钟，待冷却后测定实验组与空白组在540nm的吸光值，差值大即为酶活高，选出纤维素酶酶活高的一株菌株，将其命名为Streptomyces sp CW。

上述步骤(1)中富集培养基的组成为：CMC-Na 5g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，蒸馏水1000mL，pH6.5～7。

上述步骤(1)和步骤(2)中刚果红平板培养基组分为：CMC-Na 5g，NH₄Cl 1g，刚果红0.4g，琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH6.5～7。

上述步骤(3)产酶培养基组分为：麸皮48.9g，NH₄NO₃ 8g，K₂HPO₄ 4g，NaCl 4g，FeSO₄1g，蒸馏水1000mL。

本发明的再一个目的是提供一种所述菌株生产耐盐中性纤维素酶的方法，通过以下步骤实现：

(1)产酶培养:将Streptomyces sp CW接种于斜面高氏1号培养基，30℃培养4天后转接不含琼脂的高氏1号液体培养基，30℃200rpm下培养24小时，以5％接种量再转接发酵产酶培养基，在30℃200rpm条件下培养6天；

(2)胞外产物粗酶液的处理:将发酵液以6000rpm的转速离心5分钟，取上清液，即为粗酶液；

(3)硫酸铵分级沉淀处理：取20mL粗酶液加入(NH₄)SO₄粉末3.52g，混合均匀，静置2小试，6700rpm冷冻离心20分钟，取上清液，加入(NH₄)SO₄粉末3.96g，混合均匀，静置2小时，6700rpm冷冻离心20分钟，弃上清液，取沉淀溶于20mL 0.06M的磷酸缓冲液中，再将溶于磷酸缓冲液中酶液于0.06M磷酸缓冲液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再经0.22微米微孔滤膜过滤除杂，收集滤液；滤液即为耐盐中性纤维素酶酶液。

上述步骤(1)中，所述高氏培养基组成为：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH6.5～7.0。

上述步骤(1)中，所述产酶培养基组成为：麸皮48.9g，NH₄NO₃ 8g，K₂HPO₄ 4g，NaCl 4g，FeSO₄ 1g，蒸馏水1000mL。

本发明提供的一株产耐盐中性纤维素酶菌株，利用农业废弃物配置发酵培养基生产纤维素酶，原料简单，环保。培养方法简单，通过发酵生产能为国内用户提供一种应用较为广泛、价格较为合理的耐盐的中性条件下具有高活力的纤维素酶，本发明生产的中性纤维素酶具有耐盐的性质，可以应用于饲料添加，纺织行业，环境处理方面，因其具有耐盐性，在处理含纤维素的高盐度废水具有优势。本发明所用菌株，发酵培养基价格低廉、发酵周期短、发酵培养条件温和且在产酶过程中无需诱导，因此该菌适用于大规模的发酵生产的特点。

附图说明

图1为本发明菌株在刚果红平板上的透明圈。

图2为本发明菌株所产纤维素酶CMC-Na酶活最适的反应温度。

图3为本发明菌株所产纤维素酶CMC-Na酶活最适的反应pH。

图4为本发明菌株所产纤维素酶的耐盐性质图。

图5为本发明菌株所产纤维素酶的耐热性质图。

图6为本发明菌株所产纤维素酶的热稳定性质图。

图7为本发明菌株所产纤维素酶在不同金属离子影响下的酶活。

具体实施方式

为进一步了解本发明，下面结合实施例和附图对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明的限制。

本发明中所使用的培养基为：富集培养基的组成为：CMC-Na 5g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄0.5g，NaCl 0.5g，蒸馏水1000mL，pH6.5～7。

刚果红平板培养基组分为：CMC-Na 5g，NH₄Cl 1g，刚果红0.4g，琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH6.5～7。

产酶培养基组分为：麸皮48.9g，NH₄NO₃ 8g，K₂HPO₄ 4g，NaCl 4g，FeSO₄ 1g，蒸馏水1000mL。

高氏培养基组成为：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH6.5～7.0。

实施例1：菌株的筛选

取舟山海域采集的腐烂木头样品少量加入到液体富集培养基富集1天后，将经过富集培养后的菌液稀释到10-4，取稀释液涂布于刚果红平板上；培养5天后，用接种针挑出刚果红平板上产生明显透明圈且不同形态的菌落，转接到刚果红平板上分离单菌落，获得多株菌；将每株菌株接种于产酶培养基，28℃培养5天，取发酵后的培养基6000rpm离心5分钟获取粗酶液；实验组将适当稀释的粗酶液0.5mL，含1％CMC-Na的pH6.0的磷酸缓冲液2.0mL混合，空白组不加入粗酶液，于50℃孵育30分钟，实验组再加入2.5mL的DNS溶液，空白组同时再加入相应的粗酶液，混合均匀后沸水浴5分钟，待冷却后测定实验组与空白组在540nm的吸光值，差值大即为酶活高，选出纤维素酶酶活高的一株菌株，将其命名为Streptomyces sp CW。图1为Streptomyces sp CW在刚果红平板上形成的透明圈。该菌株的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，扩增16S rRNA基因的通用引物如下：

正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

实施例2：Streptomyces sp CW产纤维素酶

将Streptomyces sp CW接种于斜面高氏1号培养基，30℃培养4天后转接不含琼脂的高氏1号液体培养基，30℃200rpm下培养24小时，以5％接种量再转接发酵产酶培养基，在30℃200rpm条件下培养6天；将发酵液以6000rpm的转速离心5分钟，取上清液，即为粗酶液；取20mL粗酶液加入(NH₄)SO₄粉末3.52g，混合均匀，静置2小试，6700rpm冷冻离心20分钟，取上清液，加入(NH₄)SO₄粉末3.96g，混合均匀，静置2小时，6700rpm冷冻离心20分钟，弃上清液，取沉淀溶于20mL 0.06M的磷酸缓冲液中，再将溶于磷酸缓冲液中酶液于0.06M磷酸缓冲液中透析过夜；用聚乙二醇浓缩透析液，再经0.22微米微孔滤膜过滤除杂，收集滤液；滤液即为耐盐中性纤维素酶酶液。

实施例3：Streptomyces sp CW耐盐中性纤维素酶相关性质

酶的最适反应温度：将耐盐中性纤维素酶酶液分别放置不同温度下反应30分钟，测定其酶活，如图2所示:结果表明耐盐中性纤维素酶在40-60℃，都能保持较高的活力，最适温度在60℃左右。

酶的最适反应pH：将耐盐中性纤维素酶酶液分别放置不同pH值的CMC-Na底物反应30分钟，测定其酶活，如图3所示:结果表明耐盐中性纤维素酶在pH值5.0-8.0，都能保持较高的活力，最适pH在6.0-7.0之间。

酶的耐盐性质：将耐盐中性纤维素酶酶液分别放置含不同质量分数NaCl的CMC-Na底物反应30分钟，测定其酶活，如图4所示：结果表明耐盐中性纤维素酶在含14％质量分数的NaCl时还能保持80％的酶活力，具有良好的耐盐性质。

酶的耐热性质：将耐盐中性纤维素酶酶液分别放置于40℃、50℃、55℃、60℃、70℃水浴1小时，然后测定酶活，如图5所示：结果表明耐盐中性纤维素酶在50℃以下有很好的保持酶活力，55℃也能保持85％的酶活力。

酶的热稳定性质：将耐盐中性纤维素酶液分别置于50℃、60℃、65℃中水浴，每隔2小时取酶液测定酶活，如图6所示：结果表明耐盐中性纤维素酶在50℃能很好保持酶活力，孵育12小时还能保持85％以上的酶活力。

金属离子对酶活力的影响：配置含5mmol/L、10mmol/L的Na⁺、K⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺、EDTA的耐盐中性纤维素酶，分别测定上述酶液的酶活，探讨不同金属离子对耐盐中性纤维素酶的影响，结果如图7所示：在5mmol/L时Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺对酶有一定的促进作用，在10mmol/L时除了Mg²⁺，其它离子对酶均有一定的抑制作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的敬神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。