一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法与流程

本发明涉及微生物菌株筛选
技术领域：
，具体涉及一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法。
背景技术：
：阿维拉霉素(avilamycin)又称为卑霉素，可通过与肠道内异生的革兰氏阳性菌的核糖体结合，抑制相关蛋白的合成，从而维持整体益生菌群的生态平衡，同时还可通过抑制肠道微生物乳酸的产生，从而减少肠道蠕动，延迟营养物质在动物肠道的停留时间，起到促进消化与调节代谢的作用，从而促进动物生长。阿维拉霉素由于其独特的结构、安全性高、易降解、基本无残留、促生长及抗病等特性在动物饲料特别是猪和肉鸡饲料当中得以广泛应用。绿色产色链霉菌(streptomycesviridochromogene)是阿维拉霉素的产生菌。目前，全球阿维拉霉素的生产被美国礼来公司垄断，其首先开发并进行销售的10％预混剂类型,已在世界40多个国家登记上市。并且我国也在本世纪初将其引入，商品名为“效美素”(maxus)，而且目前礼来已经申请到阿维拉霉素20％预混剂，在饲料行业限抗的今天，其市场前景非常看好。2005年前后，国内开始有对阿维拉霉素菌株的选育及发酵条件的研究报道，然而，相关的研究尚处于初级阶段，产素水平较低，而且发酵中杂质成分多，进而对后续分离纯化带来困难，增加生产成本，究其原因，还是菌株的发酵水平不行。如何获得高效积累有效成分的优良菌株成为开发改产品的关键技术瓶颈。artp(atmosphericandroomtemperatureplasma，artp)诱变技术是指在常温常压环境下通过产生高活性的等离子体射流，致使细胞受到多样性的损伤，从而起到基因突变的效果。artp生物育种技术正以其操作的简便性、安全无毒性和高效性等特点得到了广泛认可，并且在微生物育种领域的发挥着重要作用。s.viridochromogene作为一类放线菌，呈菌丝状生长，并且以孢子繁殖，而且具有细胞壁，直接诱变处理，往往处理效果不好，而且会由于菌丝分散不均匀，导致诱变处理效果不佳，另外，孢子的特殊结构往往使得其对诱变剂不敏感，会形成很多的假阳性效果。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法。本发明首先制备绿色产色链霉菌原生质体，采用artr系统对原生质体进行诱变，结合诱变菌株的形态特征和菌落抑菌生物效价进行初筛，然后通过摇瓶复筛，以阿维拉霉素抑菌效价及阿维拉霉素a组分含量为指标进行筛选，筛选得到的菌株具有发酵稳定性高，阿维拉霉素产量高，而且有效组分含量高的优点。本发明降低了制备相关产品的成本，显示了非常好的工业化应用潜力。本发明通过以下技术方案实现：一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：s1.取活化培养好的绿色产色链霉菌斜面一支，作为出发菌株，加入4～6ml无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按4％～6％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50ml种子培养基的250ml带挡板三角摇瓶，27～29℃，210～230rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液5000～7000rpm，4℃离心5～10min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；s2.以smm溶液作为渗透压稳定剂，在步骤s1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为9mgml-1～15mgml-1溶壁酶5ml，30℃条件下分别酶解45min～75min，温育结束后，采用无菌脱脂棉过滤除去未酶解的菌丝，收集滤液，4℃，2000rpm离心10min，弃上清，然后再用smm溶液洗涤离心两次，最后用3ml的smm溶液重悬细胞，得到原生质体悬液；s3.将步骤s2原生质体悬液置于无菌的试管中，进行artp诱变：预设以氦气作为工作载气，设定功率为115w，通气量为10lmin-1，等离子发射源与样品之间的距离为1～3mm，处理30～50s；s4.将步骤s3artp诱变处理后的原生质体涂布于再生平板并置于28℃恒温培养箱培养3天，选择菌落大小、形状、外观形态发生变化的单菌落转接至另外的固体平板，27～29℃继续恒温培养2天，培养结束后采用灭过菌的的打孔器将单个菌落打下，并置于无菌湿润的无菌小盘中继续培养3天，至菌丝长满培养基表面；然后取菌落小块置于含有1％的检菌的琼脂平板上，37℃培养24h后观察并测定琼脂块抑菌圈大小，同挑选抑菌圈比出发菌株大的菌株；s5.将步骤s4筛选获得的菌落从斜面接种至种子摇瓶，然后再转接发酵摇瓶，27～29℃，210～230rpm，振荡培养72h，收集发酵液；取10ml发酵液至10ml离心管中，6000×g离心10min，弃上清，甲醇重悬后转移至100ml容量瓶中，40khz频率超声40min，冷却，甲醇定容，0.45μm过滤膜过滤，进行生物抑菌效价检测，同时采用hplc法检测阿维拉霉素a的含量，挑选出抑菌效价高，阿维拉霉素a的产量高的菌株。优选地，步骤s1中所述种子培养基配方及浓度为：可溶性淀粉20.0g/l，豆粕提取粉8.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，d-木糖7.5g/l，caco30.5g/l，feso40.01g/l，mgso40.5g/l，mncl20.5g/l，naoh调节ph7.2-7.5。优选地，步骤s1中所述磷酸高渗缓冲液由0.1mol/lph6.0磷酸缓冲液中加入终浓度为0.8mol/l甘露醇制备而成。优选地，步骤s2中所述smm缓冲液由以下成分及含量组成：0.5mol/l蔗糖、20mol/lmgc12、0.02mol/l顺丁烯二酸钠盐，naoh调ph6.5。优选地，步骤s2中加入12mgml-1溶壁酶5ml，30℃条件下酶解60min。优选地，步骤s3中artp诱变处理时间为40s。优选地，步骤s3再生平板中所用再生培养基为：可溶性淀粉20.0g/l，mgso40.35g/l，kno31.2g/l，k2hpo40.25g/l，kh2po40.55g/l，feso40.01g/l，nacl0.5g/l，琼脂粉20.0g/l和110g/l的蔗糖，naoh调节ph7.2-7.5。优选地，步骤s4中所用检菌为藤黄微球菌。优选地，步骤s5中发酵所用培养基为：可溶性淀粉20.0g/l，豆粕提取粉8.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，d-木糖7.5g/l，l-缬氨酸3.0g/l，caco30.5g/l，feso40.01g/l，mgso40.5g/l，mncl20.5g/l，naoh调节ph7.2-7.5。本发明以活化斜面孢子悬液接种的摇瓶种子培养24h后获得的菌体作为出发菌丝体，采用高效溶壁酶为去壁酶，最佳酶浓度为12mgml-1，最佳酶解时间为60min，所得的原生质体数不仅较多，而且质量最好，再生率最高。为获得更多的细胞损伤，最大限度的获得突变菌株库，以制备的s.viridochromogeneavl4原生质体为研究对象，采用artp诱变系统对其进行诱变处理，在综合考虑致死率及菌落数的条件下，选择最佳的处理时间40s，并结合诱变菌株的形态特征和菌落抑菌生物效价进行初筛，获得生物抑菌效价显著提高的正突变株，然后通过摇瓶复筛，以阿维拉霉素抑菌效价及有效成分——阿维拉霉素a组分含量为指标，获得抑菌效价最高，且阿维拉霉素a组分含量最高的菌株。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)筛选得到的突变株摇瓶发酵条件下，阿维拉霉素抑菌效价较出发菌株提高19.3％，其中阿维拉霉素a组分含量提高6.4％，而且斜面转接五代，摇瓶检测生物抑菌效价，体现了较好的遗传稳定性；(2)对突变株进行50l罐的发酵验证，其阿维拉霉素抑菌效价最高达4500uml-1，较原始出发菌株avl4提高27.4％，而且展现了非常好的耐受恶劣环境的发酵特性；(3)本研究通过原生质体选育获得的菌株体现了非常优良的性能，发酵稳定，发酵得到的阿维拉霉素产量高，而且有效组分含量高，降低了制备相关产品的成本，显示了非常好的工业化应用潜力。说明书附图图1：突变株s251的50l罐发酵曲线；图2：突变株s251发酵液中阿维拉霉素hplc分析图谱。具体实施方式下面将结合说明书附图和实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。绿色产色链霉菌avl4(streptomycinviridochromogeneavl4)，摇瓶发酵效价为610uml-1，50l罐最高效价达3860uml-1，本公司研究院保存。检菌：藤黄微球菌(micrococcusluteuscicc10209)，购自中国工业微生物菌种保藏中心。实施例1培养基及缓冲液的制备方法斜面及固体平板培养基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，mgso40.35，kno31.2，k2hpo40.25，kh2po40.55，feso40.01，nacl0.5g/l，琼脂粉20.0，naoh调节ph7.2-7.5，121℃灭菌20min，备用。种子培养基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，豆粕提取粉8.0，大豆蛋白胨5.0，d-木糖7.5，caco30.5，feso40.01，mgso40.5，mncl20.5，naoh调节ph7.2-7.5，121℃灭菌25min，备用。发酵培养基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，豆粕提取粉8.0，大豆蛋白胨5.0，d-木糖7.5，l-缬氨酸3.0，caco30.5，feso40.01，mgso40.5，mncl20.5，naoh调节ph7.2-7.5，121℃灭菌25min，备用。再生培养基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，mgso40.35，kno31.2，k2hpo40.25，kh2po40.55，feso40.01，nacl0.5，琼脂粉20.0和110的蔗糖，naoh调节ph7.2-7.5。检菌液体培养基(gl-1)：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，nacl5.0g，naoh调节ph至7.0，121℃灭菌20min，备用。其中在液体培养基基础上添加15.0gl-1的琼脂粉即为固体培养基。磷酸盐高渗缓冲液：0.1mol/lph6.0磷酸缓冲液.的基础上加入终浓度为0.8mol/l甘露醇制备而成。smm缓冲液：0.5mol/l蔗糖、20mol/lmgc12、0.02mol/l顺丁烯二酸钠盐，naoh调ph6.5，115℃min灭菌18min，备用。实施例2一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法所述阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：s1.取活化培养好的绿色产色链霉菌种avl4斜面一支，作为出发菌株，加入5ml无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按5％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50ml种子培养基的250ml带挡板三角摇瓶，28℃，220rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液6000rpm，4℃离心10min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；s2.以smm溶液作为渗透压稳定剂，在步骤s1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为12mgml-1溶壁酶5ml，30℃条件下分别酶解60min，温育结束后，采用无菌脱脂棉过滤除去未酶解的菌丝，收集滤液，4℃，2000rpm离心10min，弃上清，然后再用smm溶液洗涤离心两次，最后用3ml的smm溶液重悬细胞，得到原生质体悬液；s3.将步骤s2原生质体悬液置于无菌的试管中，进行artp诱变：预设以氦气作为工作载气，设定功率为115w，通气量为10lmin-1，等离子发射源与样品之间的距离为2mm，处理40s；s4.将步骤s3artp诱变处理后的原生质体涂布于再生平板并置于28℃恒温培养箱培养3天，选择菌落大小、形状、外观形态发生变化的单菌落转接至另外的固体平板，28℃继续恒温培养2天，培养结束后采用灭过菌的的打孔器将单个菌落打下，并置于无菌湿润的无菌小盘中继续培养3天，至菌丝长满培养基表面；然后取菌落小块置于含有1％的检菌的琼脂平板上，37℃培养24h后观察并测定琼脂块抑菌圈大小，挑选抑菌圈比出发菌株大的菌株；s5.将步骤s4筛选获得的菌落从斜面接种至种子摇瓶，然后再转接发酵摇瓶，28℃，220rpm，振荡培养72h，收集发酵液；取10ml发酵液至10ml离心管中，6000×g离心10min，弃上清，甲醇重悬后转移至100ml容量瓶中，40khz频率超声40min，冷却，甲醇定容，0.45μm过滤膜过滤，进行生物抑菌效价检测，同时采用hplc法检测阿维拉霉素a的含量，挑选出抑菌效价高，阿维拉霉素a的产量高的菌株。所用培养基及缓冲液均按实施例1方法制得。实施例3一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法所述阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：s1.取活化培养好的绿色产色链霉菌avl4斜面一支，作为出发菌株，加入4ml无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按4％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50ml种子培养基的250ml带挡板三角摇瓶，27℃，210rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液5000rpm，4℃离心5min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；s2.以smm溶液作为渗透压稳定剂，在步骤s1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为9mgml-1溶壁酶5ml，30℃条件下分别酶解45min，温育结束后，采用无菌脱脂棉过滤除去未酶解的菌丝，收集滤液，4℃，2000rpm离心10min，弃上清，然后再用smm溶液洗涤离心两次，最后用3ml的smm溶液重悬细胞，得到原生质体悬液；s3.将步骤s2原生质体悬液置于无菌的试管中，进行artp诱变：预设以氦气作为工作载气，设定功率为115w，通气量为10lmin-1，等离子发射源与样品之间的距离为2mm，处理30s；s4.将步骤s3artp诱变处理后的原生质体涂布于再生平板并置于28℃恒温培养箱培养3天，选择菌落大小、形状、外观形态发生变化的单菌落转接至另外的固体平板，27℃继续恒温培养2天，培养结束后采用灭过菌的的打孔器将单个菌落打下，并置于无菌湿润的无菌小盘中继续培养3天，至菌丝长满培养基表面；然后取菌落小块置于含有1％的检菌的琼脂平板上，37℃培养24h后观察并测定琼脂块抑菌圈大小，挑选抑菌圈比出发菌株大的菌株；s5.将步骤s4筛选获得的菌落从斜面接种至种子摇瓶，然后再转接发酵摇瓶，27℃，210rpm，振荡培养72h，收集发酵液；取10ml发酵液至10ml离心管中，6000×g离心10min，弃上清，甲醇重悬后转移至100ml容量瓶中，40khz频率超声40min，冷却，甲醇定容，0.45μm过滤膜过滤，进行生物抑菌效价检测，同时采用hplc法检测阿维拉霉素a的含量，挑选出抑菌效价高，阿维拉霉素a的产量高的菌株。所用培养基及缓冲液均按实施例1方法制得。实验例4一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法所述阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：s1.取活化培养好的绿色产色链霉菌avl4斜面一支，作为出发菌株，加入4～6ml无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按6％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50ml种子培养基的250ml带挡板三角摇瓶，29℃，230rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液7000rpm，4℃离心10min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；s2.以smm溶液作为渗透压稳定剂，在步骤s1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为15mgml-1溶壁酶5ml，30℃条件下分别酶解75min，温育结束后，采用无菌脱脂棉过滤除去未酶解的菌丝，收集滤液，4℃，2000rpm离心10min，去上清，然后再用smm溶液洗涤离心两次，最后用3ml的smm溶液重悬细胞，得到原生质体悬液；s3.将步骤s2原生质体悬液置于无菌的试管中，进行artp诱变：预设以氦气作为工作载气，设定功率为115w，通气量为10lmin-1，等离子发射源与样品之间的距离为2mm，处理50s；s4.将步骤s3artp诱变处理后的原生质体涂布于再生平板并置于28℃恒温培养箱培养3天，选择菌落大小、形状、外观形态发生变化的单菌落转接至另外的固体平板，29℃继续恒温培养2天，培养结束后采用灭过菌的的打孔器将单个菌落打下，并置于无菌湿润的无菌小盘中继续培养3天，至菌丝长满培养基表面；然后取菌落小块置于含有1％的检菌的琼脂平板上，37℃培养24h后观察并测定琼脂块抑菌圈大小，挑选抑菌圈比出发菌株大的菌株；s5.将步骤s4筛选获得的菌落从斜面接种至种子摇瓶，然后再转接发酵摇瓶，29℃，230rpm，振荡培养72h，收集发酵液；取10ml发酵液至10ml离心管中，6000×g离心10min，弃上清，甲醇重悬后转移至100ml容量瓶中，40khz频率超声40min，冷却，甲醇定容，0.45μm过滤膜过滤，进行生物抑菌效价检测，同时采用hplc法检测阿维拉霉素a的含量，挑选出抑菌效价高，阿维拉霉素a的产量高的菌株。所用培养基及缓冲液均按实施例1方法制得。对比例1一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法所述阿维拉霉素高产菌株的筛选方法与实施例2的区别在于步骤s2中加入终浓度为6mgml-1溶壁酶，其它步骤均与实施例2类似。对比例2一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法所述阿维拉霉素高产菌株的筛选方法与实施例2的区别在于步骤s2中酶解时间为90min，其它步骤均与实施例2类似。试验例1不同制备方法对原生质体形成与再生的影响1.试验材料：按实施例2～4及对比例1～2方法中s2步骤制备得到的原生质体悬液。2.试验方法：将上述不同原生质体悬液进行梯度稀释后涂布于再生培养基平板上，28℃培养4天，进行原生质体的再生，计算菌落数a。另外，进行原生质体再生的水处理对照实验，即在原生质体悬液中加入9倍无菌水，并在摇床上28℃、50rpm温育20min。而后梯度稀释后涂布于再生培养基平板上，同样28℃培养4天，计算菌落数b。原生质体再生率＝(a-b)/(c-b)×100％，其中c为出发菌丝体直接用无菌生理盐水稀释相同倍数后在出发菌株固体培养基的菌落数。3.试验结果：试验结果如表1所示。表1不同制备方法对原生质体的影响实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2再生率(％)36.222.629.619.516.3原生质体数/×108ml-11.61.11.51.751.86酶浓度过大或酶解时间过长，往往对细菌的细胞壁形成过度的水解作用，不仅细胞壁被酶解，细胞膜也受到一定程度的损伤，导致原生质体的形成量增加了，但再生率却大大降低，不利于细胞再生。酶浓度过低或酶解时间不足，酶对菌丝体的有效作用降低，导致酶解不彻底，难以形成原生质体。由表1可知，采用单一溶壁酶完全能够满足绿色产色链霉菌avl4原生质体制备的需要，采用12mgml-1的溶壁酶，30℃酶解反应60min制备的原生质体效果最好，再生率最佳。试验例2阿维拉霉素生物抑菌效价的测定方法和hplc分析1.试验材料：按实施例2筛选方法初步筛选得到的菌株抑菌圈直径大于对照菌株的突变株s91、s215。2.试验方法：采用管碟法检测发酵液抑菌效价，并根据标准曲线以及样品的抑菌圈直径计算样品的抑菌生物效价。其中，抑菌圈直径(mm)＝测量直径-孔径。取预处理的样品20μl，甲醇稀释5倍后，直接进行hplc分析3.试验结果：试验结果如表2所示。表2阿拉霉素生物效价由表2可知，管碟法测得的突变菌株s91和s215抑菌圈直径分别为15.6mm和16.1mm，阿维拉霉素生物效价为705.1uml-1和727.7uml-1，较原始出发菌株分别提高15.6％和19.3％。中变株s91的阿维拉霉素a含量为521.4μgml-1，占组分含量约73.9％，较原始出发菌株a的占比含量下降2.9％。菌株s251的阿维拉霉素a含量为589.4μgml-1，占组分含量81％，较原始出发菌株a含量提高6.4％。试验例3突变株稳定性验证1.试验材料：按实施例2筛选方法筛选得到的s215菌株。2.试验方法：采用斜面传代的方式，连续转接五代，每一代斜面菌株都进行摇瓶发酵验证抑菌生物效价，每代菌株进行三个平行样。3.试验结果：试验结果如表3所示。表3突变株s251的斜面传代对生物抑菌效价的影响由表3可知，突变株s251传代过程中生物抑菌效价变化幅度在3％以内，而且从传代的形态特征来看，菌落形态、颜色、丰度及显微形态都没有变化，体现了较好的遗传稳定性。试验例450l罐发酵验证1.试验材料：按实施例2筛选方法筛选得到的s215菌株。2.试验方法：以摇瓶种作为一级种子，采用三级发酵工艺，进行50l补料分批式发酵，一级摇瓶种至二级种子罐，移种量控制为5％，二级种子罐至发酵罐，移种量控制为20％，周期为240h。发酵罐控制参数：温度28℃，通气量1:1，罐压0.05mpa，初始搅拌150rpm，流加20％氨水控制ph在7.0-7.2，流加500gl-1葡萄糖溶液控制发酵过程中葡萄糖浓度在3.0-8.0gl-1通过控制搅拌和补料维持发酵过程溶氧(do)在20-40％，流加豆油控制发酵过程中的泡沫，发酵每隔8小时取样测定生物量(菌丝体湿重占取样体积的比例)，发酵48h后开始检测阿维拉霉素生物效价，绘制发酵曲线。3.试验结果：如图1所示。由图1可知，发酵的前32h，菌体处于适应期，菌株的生物量变化都不大，此时以初级代谢为主。发酵32h之后，变株s251较原始对照菌株avl4的生长速率明显要快，虽然两者的最高生物量差不多，都为65％左右，但s251菌株在发酵80h就达到了最高生物量，而对照菌株avl4需要96h。80h至发酵结束，菌株s251都未出现大幅度的生物量下降，说明s251菌丝体的在发酵体系的动态平衡中维持稳定的周期长，而此时主要进行次级代谢，有利于目标产物的合成与积累，而对照菌株avl4在发酵216h后，生物量出现明显下降，说明avl4菌株在发酵环境开始恶化之后，大部分菌丝体自溶，发酵体系中平衡被打破，次级代谢能力下降，目标产物合成减弱，发酵不可维持了。整个发酵过程菌株的生长状态都体现了s251菌株较强的菌丝生长优势及发酵后期的耐恶劣环境的能力，这对于进一步的工业化放大生产非常有利。从整个发酵过程中的抑菌效价的增长情况来看，阿维拉霉素的生物合成不但与菌丝体的生长密切相关，而且在菌株进入稳定期之后，次级代谢更加活跃。菌株s251阿维拉霉素效价最高在232h，达到4500uml-1，较对照菌株avl4提高27.4％，体现非常好的产素水平。不仅如此，对照菌株avl4在生物量下降之后，抑菌效价也显著降低，这可能是菌株在发酵后期，无效成分大量合成，有效成分比例下降，导致抑菌效价降低，而变株s251未出现此类现象，更进一步说明变株s251较好的发酵环境耐受性。综上所述，本发明通过原生质体选育获得的菌株体现了非常优良的性能，发酵稳定，发酵得到的阿维拉霉素产量高，而且有效组分含量高，降低了制备相关产品的成本，显示了非常好的工业化应用潜力。当前第1页12