一种多氧霉素I组分高产菌株的筛选方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种多氧霉素i组分高产菌株的筛选方法。

背景技术：

随着近代生物学技术的不断进步，相关的农业生产拥有了更加广阔的发展前景，同时快速发展的农业生产对相应的高产高效抗生素药物的需求量也日益增加。

多氧霉素(polyoxin)是一种重要的核苷肽类抗生素，由于它的结构与几丁质合成酶的天然底物udp-n-乙酰葡萄糖胺相似，因此它能够竞争性地抑制几丁质的合成，从而抑制真菌的生长。多氧霉素是一种高效、低毒、无环境污染的安全农药，在农业生产中应用广泛，对稻瘟病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病和白粉病、烟草赤星病、蔬菜白粉病、菌核病等真菌性植物病害有良好防治作用。

在微生物菌种选育过程中，诱变育种是主要方法之一。它利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其在非自然条件下随机突变频率大幅度提高，然后用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株(高产株或有效组分高产株)。

多氧霉素(polyoxin)是含有a～n14种不同同系物的混合物，各主要组份的作用又不相同，其中多氧霉素i组分(polyoxini)对烟草赤星菌具有抑制作用，但是polyoxini在多氧霉素中的含量较低，因此要提高多氧霉素对烟草赤星菌的抗菌作用，必须提高polyoxini的含量，目前还没有相关技术公开。

技术实现要素：

本发明就是为了解决现有菌株多氧霉素i组分含量较低的技术问题，提供一种多氧霉素i组分高产菌株的筛选方法，通过诱变育种筛选得到多氧霉素i组分高产菌株。

为此，本发明提供一种多氧霉素i组分高产菌株的筛选方法，其包括以下步骤：

步骤1、将多氧霉素出发菌株圈卷产色链霉菌野生型p0接种于斜面培养基恒温培养，所述斜面培养基包括以下成份，单位为g/l：可溶性淀粉：15～25；kno3：0.8～1.2；k2hpo4：0.3～0.8；mgso4·7h2o：0.3～0.8；nacl：0.3～0.8；feso4·7h2o：0.008～0.012；琼脂：15～25；

步骤2、挑选步骤1培养的孢子，并加入生理盐水，制成孢子悬液；

步骤3、按步骤1所述培养基配制不同浓度的5-氟尿嘧啶的孢子培养基，5-氟尿嘧啶浓度，分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1，单位为g/l；

步骤4、将步骤1所述的野生型菌株p0作为出发菌株，分别涂布于步骤3所述的不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；

步骤5、根据步骤4所述的孢子生长情况，选择3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，其浓度分别为0.1、0.3、1，单位为g/l；

步骤6、将步骤2所述的孢子悬液稀释，取3～5ml稀释后的孢子悬液置于无菌平板中，放置于紫外诱变箱中进行照射；

步骤7、将步骤6所述的无菌平板取出，将其上的孢子悬液稀释，并分别涂布于步骤5所述的3种不同浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基，恒温培养；

步骤8、挑选步骤7培养的突变后的单菌落，接种于步骤1所述的斜面培养基，恒温培养；

步骤9、将步骤8培养的菌落接种到种子培养基，恒温培养，所述种子培养基包括以下成份，单位为g/l：酵母提取物：8～12；胰蛋白胨：12～18；kno3：0.8～1.2；k2hpo4：0.3～0.8；mgso4·7h2o：0.3～0.8；nacl：0.3～0.8；feso4·7h2o：0.008～0.012；

步骤10、将步骤9培养的菌落按菌落与发酵培养基体积百分比8～12％的接种量接种到发酵培养基进行摇瓶发酵，同时以步骤4所述的出发菌株做对照，所述发酵培养基包括以下成份，单位为g/l：淀粉：40～60；豆粕粉：20～28；酵母提取物：3～8；甘露醇：3～8；nacl：3～8；nh4so4：0.3～0.8；caco3：1～5；

步骤11、对步骤10的发酵产物中多氧霉素组分变化进行检测，筛选与出发菌株p0次级代谢组分有差异的菌株；

步骤12、对步骤11筛选的菌株进行检测，筛选出多氧霉素i组分高产菌株。

优选的，步骤1斜面培养基包括以下成份，单位为g/l：可溶性淀粉：20；kno3：1；k2hpo4：0.5；mgso4·7h2o：0.5；nacl：0.5；feso4·7h2o：0.01；琼脂：20；所述斜面培养基的ph值为7.0。

优选的，步骤9中，种子培养基包括以下成份，单位g/l：酵母提取物：10；胰蛋白胨：16；kno3：1；k2hpo4：0.5；mgso4·7h2o：0.5；nacl：0.5；feso4·7h2o：0.01；所述种子培养基的ph值为7.0。

优选的，步骤10中，发酵培养基包括以下成份，单位为g/l：淀粉：50；豆粕粉：25；酵母提取物：5；甘露醇：5；nacl：5；nh4so4：0.5；caco3：2；所述发酵培养基的ph值为7.1。

优选的，步骤6中紫外诱变，紫外光的波长为253.5nm，紫外灯的功率为15w，紫外诱变箱与无菌平板的垂直距离为30cm，紫外光照射时间为5～10s。

优选的，步骤1的培养为在温度29℃的条件下培养5～7天。

优选的，步骤7的培养为温度28℃暗处培养10～14天。

优选的，步骤8的培养为温度28℃培养7天；所述步骤9所述的培养为在29℃、转速250rpm恒温摇床培养20～36h。

优选的，步骤10的培养为在29℃、转速250rpm恒温摇床培养3～7天。

本发明同时提供一种多氧霉素i组分高产菌株的应用，所述多氧霉素i组分高产菌株发酵液对烟草赤星菌具有抑菌作用。

本发明具有以下优点：本发明提供了一种多氧霉素i组分高产菌株的筛选方法及其应用，筛选得到多氧霉素i组分高产菌株的发酵液主要成分为多氧霉素i组分，其发酵液对烟草赤星菌具有抑菌作用。本发明的筛选方法可以理性快速地筛选高产菌株，简单易行，所涉及的培养基原料成本低、来源广，具有十分重要的工农业应用潜力。

附图说明

图1为出发菌株p0发酵液hplc分析图谱。

图2为多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液hplc分析图谱。

图3为出发菌株p0发酵液hplc-hrms分析图谱。

图4为多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液hplc-hrms分析图谱。

图5为多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液对烟草赤星菌的抗菌活性实验。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：原始菌株p0孢子制备。

1、取多氧霉素出发菌株圈卷产色链霉菌(streptomycesansochromogenes)野生型p0(该菌种购自于中国科学院成都生物研究所)接种于斜面培养基。在温度29℃的条件下培养7天，挑选斜面培养基上的孢子，加入生理盐水，制成孢子悬液。斜面培养基(100ml)，按质量体积比计，其成分为：可溶性淀粉：2g；kno3：0.1g；k2hpo4：0.05g；mgso4·7h2o：0.05g；nacl：0.05g；feso4·7h2o：0.001g；琼脂：2g；调节培养基的ph值至7.0。

2、用野生型菌株p0作为出发菌株。首先，确定5氟尿嘧啶对p0菌株的最低抑菌浓度。配制含有不同浓度5-氟尿嘧啶的孢子培养基(5-氟尿嘧啶浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1mg/ml)，分别涂布p0孢子，培养7天。0.1mg/ml浓度基本可以抑制绝大部分孢子的生长，0.3mg/ml浓度的5-氟尿嘧啶基本可以完全抑制p0的生长，因此选用含有0.1mg/ml、0.3mg/ml和1mg/ml三个浓度的5-氟尿嘧啶孢子培养基。

实施例2：多氧菌素出发菌株p0紫外诱变。

将孢子悬液稀释至10⁷/ml，取3ml混匀的单孢子悬液置于无菌平板中，放置于已预热20min的紫外诱变箱中进行照射，时间为5s～10s。其中，紫外光的波长为253.5nm，紫外灯的功率为15w，紫外诱变箱与无菌平板的垂直距离为30cm。

紫外线诱变处理后，为防止可见光下恢复突变，用黑纸包裹平板，避光静置2小时。

取出后在红光下进行梯度稀释(10^-1～10^-5)，再分别以从低浓度到高浓度的顺序涂布于含有0.1mg/ml、0.3mg/ml和1mg/ml3个不同浓度5-氟尿嘧啶的孢子斜面培养基平板中，28℃暗处培养10-14天，待单菌落长出。

同时，未经紫外处理的孢子要进行平行实验，作为对照。

实施例3：诱变子发酵筛选及发酵液分析。

挑选100株突变后单菌落划线于新的斜面培养基平板，28℃培养7天，待孢子长好。接种0.5cm²到种子培养基，250rpm，29℃，培养1天；然后按10％接种量接种到发酵培养基进行摇瓶发酵，同时以出发菌株做对照，在29℃，转速250rpm的摇床，培养5天，到衰亡期停止发酵。

种子培养基(100ml)，按质量体积比计，其成分为：酵母提取物1.0g；胰蛋白胨：1.6g；kno3：0.1g；k2hpo4：0.05g；mgso4·7h2o：0.05g；nacl：0.05g；feso4·7h2o：0.001g；培养基的ph值为7.0。

发酵培养基(100ml)，按质量体积比计，其成分为：淀粉：5g；豆粕粉：2.5g；酵母提取物：0.5g；甘露醇：0.5g；nacl：0.5g；nh4so4：0.05g；caco3：0.2g；培养基的ph值为7.1。

用hplc(高效液相色谱)检测发酵产物中多氧霉素组分变化，通过峰形的增减与相对峰面积变化筛选与出发菌株p0次级代谢组分有差异的菌株。

样品处理：取1ml发酵液，10000rpm，离心5分钟，取上清200μl，加入200μl超纯水，稀释1倍。加入80μl含0.5％三氟乙酸的甲醇，充分混匀后，最高转速(14000rpm)离心10分钟。取上清400μl于hplc进样瓶中。

hplc条件：色谱柱采用thermo250mm，4.6μmc18色谱柱。hplc流动相为10％甲醇(含0.1％三氟乙酸)，检测波长为260nm。进样体积5ul。每个样品采集时间15分钟。

图1为出发菌株p0发酵液hplc分析图谱。图2为筛选出的多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液hplc分析图谱。图2跟图1比较，峰形的增减与相对峰面积都发生了比较大的变化，可见，筛选出的菌株次级代谢产物发生了变化。

用hplc-hrms对筛选出的菌株进行检测，对ms总离子流提取多氧霉素各个组分的分子离子峰，筛选出多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株。

样品处理与hplc条件相同。

hplc-hrms条件：色谱柱采用waters150mm，2μmc18色谱柱。梯度洗脱：0～5min，10％甲醇(含0.1％甲酸)；5-20min，10％～100％甲醇(含0.1％甲酸)；20～30min，100％甲醇(含0.1％甲酸)。进样体积2ul，采集正离子。每个样品采集时间30分钟。

图3为出发菌株p0发酵液hplc-hrms分析图谱。通过定量分析，原始菌株发酵液中主要组分为多氧霉素a、多氧霉素b、多氧霉素f、多氧霉素h四个组分，而多氧霉素i组分几乎不产生。图4为筛选出的多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液hplc-hrms分析图谱。通过定量分析，多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液中多氧霉素i组分占主要成分，其它组分均降低到比较低的水平。

用hplc-hrms(高效液相色谱-高分辨质谱联用)对筛选出的菌株进行检测，对hrms总离子流提取多氧霉素各个组分的分子离子峰，筛选出多氧霉素i组分高产菌株。

通过hplc和hplc-hrms对多氧霉素i组分高产菌株发酵液中多氧霉素组分进行相对定量分析，检测结果为其主要成分为多氧霉素i组分，多氧霉素i组分组分效价为4.2g/l。

实施例4：利用牛津杯法，测定多氧霉素i组分高产菌株发酵液对烟草赤星菌的抑菌活性。

(1)烟草赤星菌菌悬液的制备：接种烟草赤星菌于pdb(土豆100g，葡萄糖10g，蒸馏水500ml，ph自然)中，30℃、200rpm、培养2天。收集培养液，用匀浆机将培养液中球状烟草赤星菌菌丝体打碎，使整个培养液达到均一悬液状态，即为烟草赤星菌菌悬液。

(2)双层平板的制备：在无菌平板中倒入20ml80℃的pda琼脂培养基(土豆100g，葡萄糖10g，琼脂10g，蒸馏水500ml，ph自然)，平放于工作台面上，待其完全冷却，即为底层培养基。取5ml50℃水浴中保温的pda培养基。按4％的接种量加入烟草赤星菌菌悬液，混合混匀后，倒入底层培养基上，晃动平板使培养基均匀铺开。

(3)抑菌活性的检测：在双层平板中均匀放置4个牛津杯，其中1个牛津杯加入200μlpdb培养基作为对照，其它3个牛津杯加入200μl多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液离心上清液。将平板置于30℃培养箱中培养24小时。图5显示，加入多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液离心上清液的牛津杯周围有明显的抑菌圈生成，说明多氧霉素i组分(polyoxini)高产菌株发酵液对烟草赤星菌具有抑制作用。