肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和 Nikkoxin F及其制备方法，属于生物医药领域。本发明通过将尼可霉素的生物合成基因簇进行突变后导入到多氧霉素工业菌株中进行异源表达。经过质谱和核磁共振检测，确定产生了两种氧霉素与尼可霉素杂合的核苷类抗生素。这两种杂合抗生素对人类或植物病原真菌具有更加显著的抗菌活性。
【专利说明】肽基核苷类杂合抗生素 Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制 备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肽基核苷类杂合抗生素 Nikkoxin E和Nikkoxin F及其制备方法,属 于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 多氧霉素与尼可霉素是核苷类抗生素的典型代表，其作用机理在于能够特异性地 抑制几丁质合成酶的活性，从而破坏真菌细胞壁的合成，实现抑制真菌的作用。多氧霉素与 尼可霉素不仅具有广谱的抗真菌活性，并且对动植物毒性较低。但由于体外活性很难转化 为体内活性，这两个抗生素未能在临床上得到广泛应用。
[0003] 深部真菌感染又称为侵袭性真菌感染，近年来随着广谱抗生素、抗肿瘤药物、糖皮 质激素和免疫抑制剂的应用，器官移植和导管介入等新型治疗手段大规模普及，恶性肿瘤、 艾滋病等临床严重疾病的发生率持续上升，导致念珠菌血症之类的深部真菌感染的发病率 不断增多。然而临床抗真菌药物的长期运用使得真菌耐药性也越来越严重，这给深部真菌 感染的预防和治疗造成巨大困难，因此目前亟待需要研发出新型的抗真菌药物来应对日益 严重的深部真菌感染问题。
【权利要求】
1. 两种肽基核苷类杂合抗生素的Nikkoxin E和Nikkoxin F，其结构如下所示：
2.权利要求1所述肽基核苷类杂合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF的制备方法，包 括以下步骤： 1) 重组菌株LSY4的构建 将质粒PJTU5701/AnikOAnikQ通过接合转移导入多氧霉素工业菌株的polOP和polF基因突变株Li3,通过apramycin抗性筛选和PCR验证，得到重组菌株LSY4 ;所述质粒 PJTU5701/AnikOAnikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因 nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是 以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP和 聚肟酸生物合成关键基因PolF中插入硫连丝菌素抗性基因而得到的双突变菌株； 2)重组菌株LSY4发酵和肽基核苷类杂合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF提取和纯 化 重组菌株LSY4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH值调节至3. 0,离心过滤后 将滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex50Wx8H+，用0.IM氨水洗脱，选择性收集组分并旋转 蒸发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品NikkoxinE和 NikkoxinF0
3.权利要求1所述肽基核苷类杂合抗生素NikkoxinE和NikkoxinF的制备方法，包 括以下步骤： 1)重组菌株LSY4的构建 将质粒PJTU5701/AnikO AnikQ通过接合转移导入多氧霉素工业菌株的polOP和 polF基因突变株Li3,通过apramycin抗性筛选和PCR验证，得到重组菌株LSY4 ;所述质粒 PJTU5701/AnikO A nikQ是以同框缺失方式将尼克霉素的核苷骨架的生物合成关键基因 nikO和4-甲酰-4-咪唑-2-酮生物合成关键基因nikQ都敲除得到的，所述突变株Li3是 以同源重组的方式在多氧霉素工业菌株中氨甲酰多聚草氨酸生物合成关键基因polOP和 聚肟酸生物合成关键基因PolF中依次插入硫连丝菌素抗性基因而得到的双突变菌株； 2) 高产菌株QL4的构建 将nikS通过NdeI和EcoRI酶切位点克隆到载体pJTU968上，再通过MfeI和EcoRI进 行双酶切获得含有红霉素启动子的nikS片段，然后再将该片段通过EcoRI酶切位点载体 PPM927上获得质粒pPM927/nikS，以接合转移方式将质粒pPM927/nikS转入重组菌株LSY4， 通过streptomycin抗性筛选和PCR验证，得到高产菌株QL4 ; 3) 高产菌株QL4发酵和肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F提取和纯化 高产菌株QL4直接进行发酵培养，用草酸将发酵液的pH值调节至3. 0,离心过滤后将 滤液用阳离子交换树脂吸附Dowex 50Wx8H+，用0. IM氨水洗脱，选择性收集组分并旋转蒸 发浓缩；用分析型HPLC进行检测，再经制备型HPLC获得杂合抗生素纯品Nikkoxin E和 Nikkoxin F0
4.权利要求1所述的肽基核苷类杂合抗生素Nikkoxin E和Nikkoxin F在制备抗真菌 药物中的应用。
【文档编号】C12R1/465GK104497104SQ201510033114
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月22日 优先权日:2015年1月22日
【发明者】陈文青, 祁建钊, 邓子新, 刘进 申请人:武汉大学