专利名称：一种多粘菌素衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多粘菌素衍生物及其制备方法。
背景技术：
多粘菌素(polymyxins)是多粘类芽孢杆菌产生的一类碱性线环状阳离子多肽抗 生素，含有一个亲水的环肽头部和一个疏水的脂肪酸尾。根据结构差异将其分为多粘菌素 A、B、C、D和E等组分，分子量都在1200D左右。多粘菌素(polymyxins) A E具有相似的抗菌 谱，对多种革兰氏阴性菌具有强烈的杀菌作用。研究表明，多粘菌素(polymyxins)可破坏 革兰氏阴性细菌细胞外膜和细胞质膜的通透性，致使胞内物质泄漏从而起到杀菌作用。另 外，多粘菌素B(p0lymyXinSB，PMB)不仅对多种革兰氏阴性细菌具有杀菌作用，而且对如革 兰氏阴性菌的内毒素(LPS)具有明显的拮抗作用。多粘菌素B具有潜在的肾毒性和神经毒 性，一度限制了它在临床上的应用。但是，由于临床上对多药耐药(multidrug-resistance， MDR)革兰氏阴性杆菌感染缺乏有效的治疗手段，近年来人们开始重新关注多粘菌素B的临 床使用。
发明内容
本发明采用可控酶解技术将多粘菌素B的N末端脂肪酸链和一个二氨基丁酸残基 切掉，然后应用选择性化学修饰技术，引入新的化学基团，制备出一种多粘菌素衍生物。该 衍生物有效的降低了多粘菌素B原有的肾毒性，且有效的提高了抗菌活性，完全可开发成 新型抗生素应用于临床。本发明所述的多粘菌素衍生物结构图如下。其中，队与R2为直链饱和烷基，分子式为_CnH(2n+1)，其中n彡5且< 10 ；R3的分子 式为-CmH2m_，其中m彡0且< 4。本发明所述的多粘菌素衍生物，其最佳实施例中，队与R2的n = 5，R3的m = 0。本发明所述的多粘菌素衍生物，其最佳实施例的分子式*C64H1(i4N16014。
本发明所述的多粘菌素衍生物，其最佳实施例的名称为N，N’ -(5_((2S， 3R)-1-((S)-4-氨基-1-氧代-1-((3S，6S，9S，12S, 15R, 18S，21S)-6，9，18-三(2-氨乙 基)-15-苯甲基-3-((R)-l-羟乙基)-12_ 异丁基-2,5,8,11，14，17，20-七氧-1,4,7,10， 13，16，19-七氮杂环二十三烷-21-基氨基)丁烷-2-基氨基)-3-羟基-1-氧代丁基-2-基 氨基甲酰基)-1，3_亚苯基)二庚烷酰胺。本发明所述的多粘菌素衍生物，其最佳实施例的英文名称为N，N’ -(5-((2S, 3R)-l-((S)-4-amino-l-oxo-l-((3S,6S,9S,12S,15R,18S,21S)-6,9, 18-tris(2-am inoethyl)-15-benzyl-3-((R)-l-hydroxyethyl)-12-isobutyl-2,5,8,11，14，17， 20-heptaoxo-l,4,7,10,13,16,19-heptaazacyclotricosan-21-ylamino)butan-2-ylamin o)-3-hydroxy-l-oxobutan-2-ylcarbamoyl)—1，3-phenylene)diheptanamide。本发明所述的多粘菌素衍生物，其最佳实施例的结构图如下。 本发明所述的多粘菌素衍生物是通过以下技术方案制备的。1.多粘菌素B的酶解(1)取一定量硫酸多粘菌素B溶于0. 07M的磷酸缓冲液(pH 7. 0)中；(2)将酰氨键水解酶溶于0. 07M的磷酸缓冲液(pH 7. 0)中，与上述硫酸多粘菌素 B溶液混合；(3)加入二硫苏糖醇；(4) 37°C温和混勻24小时后，短时间回流加热以灭活酶；(5)冷却后过滤去除变性酶，用6M的HC1调节pH至2. 0 ；(6)用正丁醇萃取四次，将水相用6M NaOH调节pH至8. 5 ；(7)再用正丁醇萃取，将水相用6M的HC1调节pH至5. 1 ；(8)将水相减压浓缩，使用S印hadex G_10脱盐柱脱盐；(9)冻干后，重溶于0. 005M的醋酸铵(pH 5. 1)溶液，上样于CM-52阳离子交换层 析柱；(10)以0. 005M到1. 0M醋酸铵(pH 5. 1)线形洗脱，收集洗脱液。2.多粘菌素B酶解产物的选择性化学修饰(1)将上述酶解后的多粘菌素B产物用水二氧杂环乙烷三乙胺(1 1 1，v/v)配置成0. 05M的溶液，加入5M的2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙腈；(2)23°C保温20分钟，加入过量甲醇氨溶液终止反应；(3)将反应液旋蒸浓缩至干，用甲醇重溶，过滤；(4)滤液中加入过量二乙醚，过滤收集沉淀；(5)将沉淀重溶后使用快速硅胶柱层析进行纯化，流动相为三乙胺甲醇二氯 甲烷(1 13 86，v/v)；(6)收集主洗脱峰，冻干后即得中间化合物；(7)将3，4_二氨基苯基酸用芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护了氨基，五氟苯基活化了羧 基后，以过量与上述中间化合物混合，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行缩合；(8)再加入哌啶以脱去芴甲氧羰酰基保护；(9)加入过量五氟苯基活化了羧基的直链脂肪酸，在二甲基甲酰胺存在的条件下 进行缩合；(10)加入三氟乙酸，在三异丙基硅烷存在的条件下脱去保护基，经HPLC纯化后， 得到最终产物。本发明所述的多粘菌素衍生物可作为临床治疗革兰氏阴性多药耐药菌感染的专 用抗生素。本发明所述的多粘菌素衍生物可应用于临床治疗微生物感染。本发明所述的多粘菌素衍生物可应用于畜牧业治疗微生物感染。本发明所述的多粘菌素衍生物可应用于各领域抑制微生物生长、繁殖。本发明从临床现实问题出发，应用可控酶解技术和选择性化学修饰技术，得到了 比多粘菌素B原药抗菌活性更高、人体毒性更小的新衍生物及其类似物。具体来说，本发明 具有以下突出的有益效果。1.有效降低了多粘菌素B的生理毒性。2.提高了多粘菌素B原药的抗菌活性。3.(Pseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae)感染提供了一种切实有效的抗生素。本发明应用可控酶解技术对多粘菌素B进行定点水解，以去除多粘菌素B的N末 端脂肪酸链及一个二氨基丁酸残基。本发明应用选择性化学修饰技术，对酶解后多粘菌素B上苏氨酸的氨基基团进行 修饰，引入3，4- 二己酰氨基苯甲酰基团、3，4- 二己酰氨基苯乙酰基团、3，4- 二己酰氨基苯 丙酰基团、3，4_ 二己酰氨基苯丁酰基团、3，4_ 二庚酰氨基苯甲酰基团、3，4_ 二庚酰氨基苯 乙酰基团、3，4_ 二庚酰氨基苯丙酰基团、3，4_ 二庚酰氨基苯丁酰基团、3，4_ 二辛酰氨基苯 甲酰基团、3，4_ 二辛酰氨基苯乙酰基团、3，4_ 二辛酰氨基苯丙酰基团、3，4_ 二辛酰氨基苯 丁酰基团、3，4_ 二壬酰氨基苯甲酰基团、3，4_ 二壬酰氨基苯乙酰基团、3，4_ 二壬酰氨基苯 丙酰基团、3，4_ 二壬酰氨基苯丁酰基团、3，4_ 二癸酰氨基苯甲酰基团、3，4_ 二癸酰氨基苯 乙酰基团、3，4- 二癸酰氨基苯丙酰基团、3，4- 二癸酰氨基苯丁酰基团。所引入基团的结构图如下。
其中，队与R2为直链饱和烷基，分子式为_CnH(2n+1)，其中n彡5且< 10 ；R3的分子 式为_CnH2n-，其中n彡0且< 4。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 对多粘菌素B进行酶解，步骤如下(1)取35克硫酸多粘菌素B溶于3升0. 07M的磷酸缓冲液(pH 7. 0)中；(2)将6，000U无花果蛋白酶溶于0. 5升0. 07M的磷酸缓冲液(pH 7. 0)中，与上述 硫酸多粘菌素B溶液混合；(3)加入1克二硫苏糖醇；(4) 37°C温和混勻24小时后，短时间回流加热以灭活酶；(5)冷却后过滤去除变性酶，用6M的HC1调节pH至2. 0 ；(6)用0. 25升正丁醇萃取四次，将水相用6M NaOH调节pH至8. 5 ；(7)再用正丁醇萃取，将水相用6M的HC1调节pH至5. 1 ；(8)将水相减压浓缩至0. 2升，使用S印hadex G_10脱盐柱脱盐；(9)冻干后，重溶于0. 005M的醋酸铵(pH 5. 1)溶液，上样于CM-52阳离子交换层 析柱；(10)以0. 005M到1. 0M醋酸铵(pH 5. 1)线形洗脱，收集洗脱液。
实施例2 对酶解产物的化学修饰，步骤如下(1)将上述酶解后的多粘菌素B产物用水二氧杂环乙烷三乙胺(1 1 1， v/v)配置成0. 05M的溶液，加入5M的2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙腈；(2) 23°C保温20分钟，加入过量甲醇氨溶液终止反应；(3)将反应液旋蒸浓缩至干，用甲醇重溶，过滤；(4)滤液中加入过量二乙醚，过滤收集沉淀；(5)将沉淀重溶后使用快速硅胶柱层析进行纯化，流动相为三乙胺甲醇二氯 甲烷(1 13 86，v/v)；(6)收集主洗脱峰，冻干后即得中间化合物；(7)将该中间化合物与过量芴甲氧羰酰基(Fmoc)-3，4- 二氨基苯甲酸-五氟苯基 酯混合，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行缩合；(8)再加入哌啶以脱去Fmoc保护；(9)加入过量的正己酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；
(10)加入三氟乙酸，在三异丙基硅烷存在的条件下脱去保护基，经HPLC纯化后， 得到最终产物。实施例3 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤(6)同实施例2，步骤(7)如 下(7)将该中间化合物与过量芴甲氧羰酰基(Fmoc)-3，4- 二氨基苯乙酸-五氟苯基 酯混合，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行缩合；步骤⑶至步骤(10)同实施例2。实施例4 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤(6)同实施例2，步骤(7)如 下(7)将该中间化合物与过量芴甲氧羰酰基(Fmoc)-3，4- 二氨基苯丙酸-五氟苯基 酯混合，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行缩合；步骤⑶至步骤(10)同实施例2。实施例5 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤(6)同实施例2，步骤(7)如 下(7)将该中间化合物与过量芴甲氧羰酰基(Fmoc)-3，4- 二氨基苯丁酸-五氟苯基 酯混合，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行缩合；步骤(8)至步骤(10)同实施例2。实施例6 对酶解产物的化学修饰，步骤(1)至步骤(8)同实施例2，步骤(9)如 下(9)加入过量的正庚酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例2。实施例7 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例3，步骤(9)如 下(9)加入过量的正庚酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例3。实施例8 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例4，步骤(9)如 下(9)加入过量的正庚酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例4。实施例9 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例5，步骤(9)如 下(9)加入过量的正庚酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例5。实施例10 对酶解产物的化学修饰，步骤(1)至步骤⑶同实施例2，步骤(9)如 下
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(9)加入过量的正辛酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例2。实施例11 对酶解产物的化学修饰，步骤(1)至步骤(8)同实施例3，步骤(9)如 下(9)加入过量的正辛酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例3。实施例12 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例4，步骤(9)如 下(9)加入过量的正辛酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例4。实施例13 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例5，步骤(9)如 下(9)加入过量的正辛酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例5。实施例14 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例2，步骤(9)如 下(9)加入过量的正壬酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例2。实施例15 对酶解产物的化学修饰，步骤(1)至步骤⑶同实施例3，步骤(9)如 下(9)加入过量的正壬酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例3。实施例16 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例4，步骤(9)如 下(9)加入过量的正壬酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例4。实施例17 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例5，步骤(9)如 下(9)加入过量的正壬酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例5。实施例18 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例2，步骤(9)如下(9)加入过量的正癸酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例2。实施例19 对酶解产物的化学修饰，步骤⑴至步骤⑶同实施例3，步骤(9)如 下(9)加入过量的正癸酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例3。实施例20 对酶解产物的化学修饰，步骤(1)至步骤⑶同实施例4，步骤(9)如 下(9)加入过量的正癸酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例4。实施例21 对酶解产物的化学修饰，步骤(1)至步骤(8)同实施例5，步骤(9)如 下(9)加入过量的正癸酸-1-五氟苯基羧酸酯，在二甲基甲酰胺存在的条件下进行 缩合；步骤(10)同实施例5。实验例1 新型多粘菌素衍生物的抗菌活性实验1.1试验材料1.1.1试剂与耗材培养基Cation-adjusted Mueller-Hinton 肉汤，营养琼月旨(Oxoid， Hampshire, England)；受试品依据本发明技术方案制备的多粘菌素衍生物最佳实施例产品；对照品多粘菌素B硫酸盐(Sigma-Aldrich)；96 孔板，0. 22iim 滤器。1.1. 2 受试菌绿月农杆菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 禾口 20 株临床分离株)；鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii ATCC 19606 和 20 株临床分离株)；肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae ATCC13883 和 20 株临床分离株)。1. 1.3仪器与设备麦式细菌浓度测量仪1.2实验方法使用金属离子调整的Mueller-Hinton肉汤培养基，通过微量液体稀释法测定最 小抑菌浓度(MIC)，所执行的标准为美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准。1.3结果与讨论通过对3种ATCC标准菌进行测试，所获得多粘菌素B硫酸盐对照品与受试品的 MIC见下表。
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表1受试品与对照品的MIC比较 另外，对每种受试菌的20株临床分离菌株也进行了测试，这些临床分离菌株来源 于15个不同的临床中心，并包括10株多粘菌素B及多粘菌素E抗性菌株(MIC > 128mg/ L)。结果显示，受试品的抗性范围为0. 125 2mg/L。上述体外试验数据表明，依据本发明制备的多粘菌素衍生物比多粘菌素B具备更 高的抗菌活性。实验例2 新型多粘菌素衍生物的毒性研究2.1试验材料2. 1.1试剂与耗材受试品与对照品同实验例1 ；对硝基酚，2-氨基-2-甲基-1-丙醇。2. 1.2 动物雄性Wistar大鼠(6 8周，210 280g) 24只，由山东大学实验动物中心提供，合 格证编号SCXK(鲁)-20030004。2. 1.3仪器与设备紫外分光光度仪2. 2实验方法将受试大鼠随机分为三组，每组8只。I组为对照组，以lmg/kg/12h的量，多粘菌 素B硫酸盐静脉注射给药；II组为受试组，以lmg/kg/12h的量，受试品静脉注射给药；III 组为安慰剂组，以生理盐水为安慰剂，每12小时注射给药。模拟标准临床抗生素治疗，连续 给药7天。在第一次给药前两天，用的戊巴比妥钠麻醉受试大鼠，手术放置颈静脉插管， 以利于给药。取受试大鼠尿液，以对硝基酚为N-乙酰-D氨基葡糖苷酶底物，37°C温浴 60分钟后，加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇，检测405nm处光吸收值的变化，从而检测N-乙 酰-D氨基葡糖苷酶的变化，以之作为标记进行肾毒性评价。2. 3结果与讨论三组受试大鼠在试验期间行动正常，未见明显的神经中毒现象。对照组从第四天 开始，尿液中N-乙酰-3-D氨基葡糖苷酶含量上升，从而表现出药物对受试动物的轻度肾 毒性。受试组动物到第六天才发生N-乙酰-3-D氨基葡糖苷酶上升现象。因此，依据本发 明制备的多粘菌素衍生物比多粘菌素B具备更好的安全性。而多粘菌素B目前在美国、新加坡、巴西等国作为临床药物广泛使用，本发明所述的多粘菌素衍生物相对更具优势。
综上所述，本发明所制备的新型多粘菌素衍生物具备低毒高抗菌活性，完全可以 成为一种新型的临床用抗生素。
权利要求
一种多粘菌素衍生物，其特征在于，具有如下所示结构图其中，R1与R2为直链饱和烷基，分子式为-CnH(2n+1)，其中n≥5且＜10；R3的分子式为-CmH2m-，其中m≥0且＜4。F200910020407XC0000011.tif
2.如权利要求1所述的多粘菌素衍生物，其特征在于R1与R2的η= 5，R3的m = 0，其 分子式为C64Hltl4N16O14,具有如下所示结构图
3.如权利要求1所述的多粘菌素衍生物的制备方法，其特征在于所述多粘菌素衍生 物为应用可控酶解技术去除多粘菌素B的N末端脂肪酸链及一个二氨基丁酸残基后，应用 选择性化学修饰技术在苏氨酸的氨基上引入带两个脂肪酸链的苯环基团而制得。具体步骤 如下(1)取35克多粘菌素B原药，加入6000U酰氨键水解酶和1克二硫苏糖醇，37°C酶解 24小时；(2)加热灭活酶，过滤，调节pH至2.0，用正丁醇萃取；(3)萃取后的水相调节pH至8.5，再用正丁醇萃取；(4)萃取后的水相调节pH至5.1，减压浓缩至0. 2升，使用Si^phadex G-IO脱盐柱脱(5)冻干后，重溶于0.005M的醋酸铵(pH 5. 1)溶液，上样于CM-52阳离子交换层析柱， 以0. 005M到1. OM醋酸铵(pH 5. 1)线形洗脱，收集洗脱液，即为多粘菌素B酶解产物；(6)以叔丁氧羰基进行多粘菌素B酶解产物的氨基保护；(7)加入过量甲醇氨溶液终止反应，旋蒸浓缩至干，用甲醇重溶，过滤；(8)滤液中加入过量二乙醚，过滤收集沉淀，将沉淀重溶后使用快速硅胶柱层析进行纯 化，流动相为三乙胺甲醇二氯甲烷(1 13 86)；(9)氨基保护后的多粘菌素B酶解产物与芴甲氧羰酰基保护了氨基、五氟苯基活化了 羧基的3，4- 二氨基苯基酸进行第一步缩合反应。(10)完成第一步缩合反应后，加入五氟苯基活化了羧基的直链脂肪酸进行第二步缩合 反应。(11)加入三氟乙酸，以去除保护基团，经HPLC纯化后，得到最终产物。
4.如权利要求3所述的多粘菌素衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述酰氨键 水解酶为无花果蛋白酶或木瓜蛋白酶。
5.如权利要求3所述的多粘菌素衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述以叔丁 氧羰基进行的氨基保护按如下步骤进行用水二氧杂环乙烷三乙胺(1 1 1)配置 成0. 05M的溶液，加入5M 2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙腈，23°C保温20分钟进行氨 基保护；
6.如权利要求3所述的多粘菌素衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(9)所述芴甲 氧羰酰基保护了氨基、五氟苯基活化了羧基的3，4- 二氨基苯基酸为芴甲氧羰酰基-3，4- 二 氨基苯甲酸-五氟苯基酯、芴甲氧羰酰基-3，4- 二氨基苯乙酸-五氟苯基酯、芴甲氧羰酰 基-3，4- 二氨基苯丙酸-五氟苯基酯或芴甲氧羰酰基_3，4- 二氨基苯丁酸-五氟苯基酯。
7.如权利要求3所述的多粘菌素衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(10)所述五氟 苯基活化了羧基的直链脂肪酸包括正己酸-ι-五氟苯基羧酸酯、正庚酸-ι-五氟苯基羧酸 酯、正辛酸-1-五氟苯基羧酸酯、正壬酸-1-五氟苯基羧酸酯或正癸酸-1-五氟苯基羧酸 酯。
全文摘要
本发明公开了一种多粘菌素衍生物及其制备方法。该衍生物是通过酶解将多粘菌素B的N末端脂肪酸链和一个二氨基丁酸残基切除，再通过化学修饰技术引入3，4-二己酰氨基苯甲酰基团或与之类似的带两个脂肪酸链的苯环基团而获得的。该衍生物可用于临床治疗革兰氏阴性多药耐药菌感染。
文档编号C07K1/107GK101851270SQ20091002040
公开日2010年10月6日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者梁浩, 滕峰 申请人:梁浩;滕峰