专利名称：一种从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法。
背景技术：
血红蛋白是所有脊椎动物(包括人类)和部分无脊椎动物血液中所含 有的一大类含铁的呼吸蛋白，除具有运输氧气的主要功能外，还具有稳定 血压、抗菌、运输硫化物、调节酸碱平衡、氧化酶、过氧化酶活性等多种 生物学功能，是最具有研究价值的蛋白质家族之一。
毛蚶(5^p/2wca w6c^"W")是隶属于软体动物门瓣鳃纲的一种具有 重要经济价值的海洋无脊椎动物，其免疫反应比较原始、缺乏真正意义上 的抗体、没有免疫记忆能力，只能依靠先天性免疫反应来抵御寄生虫和疾 病。在其对生存环境中多种病原微生物的免疫防御反应中，血细胞起着决 定性的作用。同时，毛蚶的血淋巴中含有大量的血红蛋白也具有抑菌活性 和类酚氧化酶活性等，在免疫防御反应中也承担着重要功能，对毛蚶血红 蛋白的研究对于揭示血红蛋白在无脊椎动物中的多重生物学功能以及各种 呼吸蛋白之间的进化关系具有重要的科学价值，因而也引起了科学家们的 广泛关注。毛蚶血红蛋白的分离纯化是开展毛蚶血红蛋白多重生物学功能 研究的基础和前提，但遗憾的是，至今仍未检索到有关毛蚶血红蛋白分离 纯化技术方法的报道。
发明内容
本发明的目的就是建立一种从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法，以弥 补已有技术的不足，为研究其多重生物学功能奠定基础。
首先，取新鲜毛蚶，经消毒过滤海水清洗后，将吸有预冷Alsever氏抗 凝剂的注射器插入毛蚶鳃部取血，所得血淋巴在4"C条件下经过离心收集血 细胞沉淀，用pH7.2的50mMHepes缓冲液将血细胞悬浮后，置-80。C和4'C 反复冻融2~3次以破碎血细胞，在4-C条件下经8000-9000转/分高速离心 后收集上清液，用Centricon-lO浓縮离心管在4t条件下浓縮至0.5毫升， 即为毛蚶血红蛋白粗品。
在4。C层析柜中，将0.5毫升毛蚶血红蛋白粗品上样于已用上述Hepes 缓冲液预平衡2小时的Superdex 200 (16mmx400mm)凝胶过滤柱进行第 一步柱层析纯化，以流速0.5毫升/分进行洗脱，以l毫升/管的量分部收集 洗脱组分，检测各洗脱组分在波长415nm的光吸收值，收集具有高吸收值 的洗脱组分，经Centricon-10浓縮离心管在4。C条件下浓縮至0.5毫升，再 上样于已用上述Hepes缓冲液预平衡2小时的Sephacryl S-100凝胶过滤柱 (16mmx400mm)进行第二步柱层析纯化，以流速0.5毫升/分进行洗脱， 以1毫升/管的量分部收集洗脱组分，检测各洗脱组分在波长415nm的光吸收值，收集具有最高光吸收峰值的洗脱组分，即为毛蚶血红蛋白纯化样品。 本发明方法简便、重复性好且血红蛋白的得率高，所纯化的血红蛋白
仍保持有四级结构和天然活性，便于进行其多重生物学功能研究。
具体实施例方式
本发明给出详细具体的分离纯化方法。
1、取新鲜毛蚶1000克，放入盛有消毒过滤海水的玻璃缸中清洗2~3 次，用5毫升注射器吸入2毫升预冷Alsever氏抗凝剂(葡萄糖2.05克， 柠檬酸钠0.8克，氯化钠0.42克，用重蒸水定容至IOO毫升)，插入毛蚶鳃 部取血，抗凝剂与血淋巴的体积比始终保持在1:1，放入50毫升离心管中， 混匀后在4'C条件下1500~2000转/分离心20 25分钟，小心吸出离心上清 液，加入1毫升pH7.2的50mM Hepes缓冲液充分悬浮血细胞沉淀，放-80。C 冷冻4小时后，取出离心管放在4'C使血细胞悬液融化，如此反复冻融2 3 次以破碎血细胞，最后将冻融后的血细胞悬液在4。C条件下8000~9000转/ 分离心50 60分钟，收集离心上清液，用Centricon-10浓縮离心管3000 4000 转/分在4'C条件下浓縮至0.5毫升，即为毛蚶血红蛋白粗品，用于下一步纯 化。
2、 将Superdex200 (16mmx400mm)凝胶过滤柱安装于4"C层析柜中， 用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将上述0.5毫 升毛蚶血红蛋白粗品上样于Superdex 200凝胶过滤柱进行第一步柱层析纯 化，用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在4。C条件下用 1.5毫升离心管按1毫升/管的量收集各洗脱组分，至少收集80管，从每管 中分别取出0.03毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓冲液充分混 匀后加入至0.3毫升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗脱组分在波 长415nm的光吸收值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的光吸收值为 纵坐标绘制洗脱曲线，收集其中具有最高光吸收峰值的洗脱组分，最多收 集3管，混匀后加入到Centricon-lO浓縮离心管中，在4'C条件下3000~4000 转/分离心浓縮至0.5毫升。
3、 将SephacrylS-100凝胶过滤柱(16mmx400mm)安装于4'C层析柜 中，用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将上述第 一步柱层析纯化的0.5毫升样品再上样于Sephaciyl S-100凝胶柱进行第二 步柱层析纯化，用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在4'C 条件下用1.5毫升离心管按1毫升/管的量收集各洗脱组分，至少收集80 管，从每管中分别取出0.03毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓 冲液充分混匀后加入至0.3毫升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗 脱组分在波长415nm的光吸收值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的 光吸收值为纵坐标绘制洗脱曲线，收集具有最高光吸收峰值的洗脱组分， 最多收集3管，即为毛蚶血红蛋白纯化样品。为便于实施本发明，下面以多个实施例给出详细具体的分离纯化方法 如下 实施例l
1、 取新鲜毛蚶1000克，放入盛有消毒过滤海水的玻璃缸中清洗2~3 次，用5毫升注射器吸入2毫升预冷Alsever氏抗凝剂(葡萄糖2.05克， 拧檬酸钠0.8克，氯化钠0.42克，用重蒸水定容至IOO毫升)，插入毛附鳃 部取血，抗凝剂与血淋巴的体积比始终保持在1:1，放入50毫升离心管中， 混匀后在4-C条件下1500转/分离心25分钟，小心吸出离心上清液，加入1 毫升pH7.2的50mM Hepes缓冲液充分悬浮血细胞沉淀，放-8(TC冷冻4小 时后，取出离心管放在4。C条件下使血细胞悬液融化，如此反复冻融2次以 破碎血细胞，最后将冻融血细胞悬液在4。C条件下8000转/分离心60分钟， 收集离心上清液，用Centricon-lO浓縮离心管在4"C条件下4000转/分离心 浓缩至0.5毫升，即为毛蚶血红蛋白粗品，用于下一步纯化。
2、 将Superdex200 (16mmx400mm)凝胶过滤柱安装于4"C层析柜中， 用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将0.5毫升毛 蚶血红蛋白粗品上样于Superdex 200凝胶过滤柱进行第一步柱层析纯化， 用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在4。C条件下用1.5 毫升离心管按1毫升/管的量收集80管洗脱组分，从每管中分别取出0.03 毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓冲液充分混匀后加入至0.3毫 升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗脱组分在波长415mn的光吸收 值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的光吸收值为纵坐标绘制洗脱曲 线，收集具有最高光吸收峰值的3管洗脱组分，混匀后加入到Centricon-lO 浓縮离心管中，在4'C条件下3500转/分离心20分钟浓縮至0.5毫升。
3、 将SephacrylS-100凝胶过滤柱(16mmx400mm)安装于4。C层析柜 中，用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将上述第 一步柱层析纯化的0.5毫升样品再上样于Sephacryl S-100凝胶柱进行第二 步柱层析纯化，用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在4'C 条件下用1.5毫升离心管按0.5毫升/管的量收集80管洗脱组分，从每管中 分别取出0.03毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓冲液充分混匀 后加入至0.3毫升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗脱组分在波长 415mn的光吸收值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的光吸收值为纵 坐标绘制洗脱曲线，收集具有最高光吸收峰值的3管洗脱组分，混匀后即 为毛蚶血红蛋白纯化样品。
实施例2
1、取新鲜毛蚶1000克，放入盛有消毒过滤海水的玻璃缸中清洗2~3 次，用5毫升注射器吸入2毫升预冷Alsever氏抗凝剂(葡萄糖2.05克， 柠檬酸钠0.8克，氯化钠0.42克，用重蒸水定容至IOO毫升)，插入毛蚶鳃部取血，抗凝剂与血淋巴的体积比始终保持在1:1,放入50毫升离心管中， 混匀后在4。C条件下2000转/分离心20分钟，小心吸出离心上清液，加入1 毫升pH7.2的50mM Hepes缓冲液充分悬浮血细胞沉淀，放-8(TC冷冻4小 时后，取出离心管放在4。C条件下使血细胞悬液融化，如此反复冻融2次以 破碎血细胞，最后将冻融血细胞悬液在4'C条件下9000转/分离心50分钟， 收集离心上清液，用Centricon-lO浓縮离心管在4'C条件下3000转/分离心 浓縮至0.5毫升，即为毛蚶血红蛋白粗品，用于下一步纯化。
2、 将Superdex200 (16mmx400mm)凝胶过滤柱安装于4"C层析柜中， 用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将0.5毫升毛 蚶血红蛋白粗品上样于Superdex 200凝胶过滤柱进行第一步柱层析纯化， 用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在4'C条件下用1.5 毫升离心管按1亳升/管的量收集80管洗脱组分，从每管中分别取出0.03 毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓冲液充分混匀后加入至0.3毫 升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗脱组分在波长415nm的光吸收 值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的光吸收值为纵坐标绘制洗脱曲 线，收集具有最高光吸收峰值的3管洗脱组分，混匀后加入Centricon-lO 浓縮离心管中，在4。C条件下用3000转/分离心13分钟浓縮至0.5毫升。
3、 将SephacrylS-100凝胶过滤柱(16mmx400mm)安装于4'C层析柜 中，用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将上述第 一步柱层析纯化的0.5毫升样品再上样于Sephacryl S-100凝胶柱进行第二 步柱层析纯化，用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在4°C 条件下用1.5毫升离心管按1毫升/管的量收集80管洗脱组分，从每管中 分别取出0.03毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓冲液充分混匀 后加入至0.3毫升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗脱组分在波长 415nm的光吸收值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的光吸收值为纵 坐标绘制洗脱曲线，收集具有最高光吸收峰值的3管洗脱组分，混匀后即 为毛蚶血红蛋白纯化样品。
实施例3
1、取新鲜毛蚶1000克，放入盛有消毒过滤海水的玻璃缸中清洗2~3 次，用5毫升注射器吸入2毫升预冷Alsever氏抗凝剂(葡萄糖2.05克， 柠檬酸钠0.8克，氯化钠0.42克，用重蒸水定容至IOO毫升)，插入毛蚶鳃 部取血，抗凝剂与血淋巴的体积比始终保持在1:1，放入50毫升离心管中， 混匀后在4。C条件下2000转/分离心20分钟，小心吸出离心上清液，加入1 毫升pH7.2的50mM Hepes缓冲液充分悬浮血细胞沉淀，放-80"C冷冻4小 时后，取出离心管放在4。C条件下使血细胞悬液融化，如此反复冻融3次以 破碎血细胞，最后将冻融血细胞悬液在4"C条件下8000转/分离心60分钟， 收集离心上清液，用Centricon-lO浓縮离心管在4"C条件下4000转/分离心浓縮至0.5毫升，即为毛蚶血红蛋白粗品，用于下一步纯化。
2、 将Superdex200 (16mmx400mm)凝胶过滤柱安装于4。C层析柜中， 用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将0.5毫升毛 蚶血红蛋白粗品上样于Superdex 200凝胶过滤柱进行第一步柱层析纯化， 用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在4"C条件下用1.5 毫升离心管按1毫升/管的量收集80管洗脱组分，从每管中分别取出0.03 毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓冲液充分混匀后加入至0.3毫 升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗脱组分在波长415nm的光吸收 值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的光吸收值为纵坐标绘制洗脱曲 线，收集具有高峰值光吸收值的3管洗脱组分，混匀后加入Centricon-lO 浓縮离心管中，在在4"C条件下4000转/分离心14分钟浓縮至0.5毫升。
3、 将SephacrylS-100凝胶过滤柱(16mmx400mm)安装于0~4°。层析 柜中，用上述Hepes缓冲液以流速0.5毫升/分进行预平衡2小时，将上述 第一步柱层析纯化的0.5毫升样品再上样于Sephacryl S-100凝胶柱进行第 二步柱层析纯化，用上述Hepes缓冲液以0.5毫升/分的流速进行洗脱，在 4'C条件下用1.5毫升离心管按1毫升/管的量收集80管洗脱组分，从每管 中分别取出0.03毫升洗脱组分，加入0.27毫升上述Hepes缓冲液充分混 匀后加入至0.3毫升微量比色皿中，用分光光度计检测各管洗脱组分在波 长415nm的光吸收值，以各管管号为横坐标、各管洗脱组分的光吸收值为 纵坐标绘制洗脱曲线，收集具有最高光吸收峰值的3管洗脱组分，混匀后 即为毛蚶血红蛋白纯化样品。
权利要求
1、一种从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法，首先将清洗后的新鲜毛蚶用注射器进行鳃部取血，离心收集血细胞沉淀并用pH7.2的50mM Hepes缓冲液悬浮血细胞，反复冻融以破碎血细胞，在4℃条件下8000-9000转/分离心收集上清液以分离出毛蚶血红蛋白，用Centricon-10浓缩离心管在4℃条件下3000～4000转/分离心，将该上清液浓缩至0.5毫升，即为毛蚶血红蛋白粗品，上样于Hepes缓冲液预平衡2小时的Superdex200凝胶过滤柱进行第一步柱层析纯化，在4℃条件下洗脱并收集各洗脱组分，分别检测各洗脱组分在波长415nm的光吸收值，收集其中的具有最高光吸收峰值的洗脱组分，经Centricon-10浓缩离心管在4℃条件下浓缩至0.5毫升，再上样于Hepes缓冲液预平衡2小时的Sephacryl S-100凝胶过滤柱进行第二步柱层析纯化，在4℃条件下洗脱并收集各洗脱组分，分别检测各洗脱组分在波长415nm的光吸收值，收集其中的具有最高光吸收峰值的洗脱组分，即为毛蚶血红蛋白纯化样品。
2、 如权利要求1所述的从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法，其特征是 上述从鳃部取血的方法是将清洗后的新鲜毛蚶，用吸有预冷Alsever氏 抗凝剂的5mL注射器插入毛蚶鳃部取血，且该抗凝剂与血淋巴的体积比始 终保持在1:1。
3、 如权利要求1所述的从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法，其特征是 上述的反复冻融是将血淋巴细胞分别在-8(TC和4-C反复冻融2 3次以充分破碎血细胞并释放出血细胞内的血红蛋白。
4、 如权利要求1所述的从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法，其特征是 上述在4。C条件下凝胶过滤柱的洗脱速度均为0.5毫升/分，各洗脱组分的 收集量均为1毫升/管。
全文摘要
本发明涉及一种从毛蚶中分离纯化血红蛋白的方法，首先用注射器插入新鲜毛蚶鳃部取血，离心收集血细胞沉淀，然后用Hepes缓冲液悬浮后，在-80℃和4℃反复冻融破碎细胞，离心收集上清液，4℃离心浓缩至0.5毫升，上样于Superdex200凝胶过滤柱，0.5毫升/分洗脱，1毫升/管收集洗脱组分，检测并收集具有波长415nm高吸收值的洗脱组分，4℃离心浓缩至0.5毫升，继续上样于SephacrylS-100凝胶过滤柱，0.5毫升/分洗脱，1毫升/管收集洗脱组分，最后检测并收集具有波长415nm最高吸收值的洗脱组分，即为毛蚶血红蛋白纯化样品。本发明方法简便、重复性好且血红蛋白的得率高，所纯化血红蛋白仍保持有四级结构和天然活性，便于进行多重生物学功能研究。
文档编号C07K14/795GK101508732SQ20091002003
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月23日 优先权日2009年3月23日
发明者张亚南, 彬 徐, 樊廷俊, 昭 荆 申请人:中国海洋大学