高纯度单体一叶萩碱的分离纯化方法与流程

本发明属于中药提取技术领域，尤其涉及一种高纯度单体一叶萩碱的分离纯化方法。

背景技术：

一叶萩，也称叶底珠，为大戟科植物。一叶萩的叶及花具有祛风活血、补肾强筋之功效，主治面神经麻痹、小儿麻痹后遗症、眩晕、耳聋、神经衰弱、嗜睡症、阳痿等。该品种在我国资源十分丰富，其根、叶和嫩枝中均含有多种生物碱，主要生物碱有一叶萩碱、二氢一叶萩碱、别一叶萩碱、右旋别一叶萩碱、右旋一叶萩碱、一叶萩亭宁、一叶萩醇碱A、B、C等，其中以一叶萩碱含量最高。

一叶萩碱和它的衍生物具有兴奋中枢神经、增强心肌收缩、升高血压等作用，临床用硝酸一叶萩碱治疗面神经麻痹、小儿麻痹骶神经炎和股外侧神经炎感染引起的多发性神经炎，成为神经科疾患的常用药物。

一叶萩碱为叔胺碱如式(I)所示(pKa7.2)，具有生物碱的一般通性，因此现有一叶萩碱的提取分离利用生物碱盐易溶于水、游离生物碱易溶于有机溶剂的性质，将原料用酸水提取，提取液过强酸型的阳离子交换树脂使生物碱被树脂吸附，然后，碱化树脂使生物碱游离，石油醚提取，回收溶剂即可得到生物碱。但此方法的提取效率较低。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种产率较高的高纯度单体一叶萩碱的分离纯化方法。

本发明提供了一种高纯度单体一叶萩碱的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1)将一叶萩用醇提取，得到提取液；

S2)将所述提取液经反相聚合物色谱填料吸附后，洗脱，得到洗脱液；

S3)将所述洗脱液经硅胶柱层析色谱纯化后，得到纯化洗脱液；

S4)将所述纯化洗脱液重结晶，得到一叶萩碱。

优选的，所述提取的温度为70℃～90℃；所述提取的时间为1～2h。

优选的，所述提取的次数为3～8次。

优选的，所述反相聚合物色谱填料为大孔树脂填料或NM系列色谱填料。

优选的，所述步骤S2)具体为：

将所述提取液经反相聚合物色谱填料吸附后，依次用水、30％～50％的醇溶液洗涤，然后用70％～90％的乙醇洗脱，得到洗脱液。

优选的，所述步骤S3)具体为：

将洗脱液减压浓缩后，用硅胶拌样，得到过柱原料；

用有机溶剂与醇溶剂对过柱原料进行梯度洗脱，得到纯化洗脱液；所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。

优选的，所述硅胶的目数为60～80目。

优选的，所述梯度洗脱具体为：100％有机溶剂；待杂质基本除净后，有机溶剂与醇溶剂的体积比为(40～60)：1，得到纯化洗脱液；所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。

优选的，所述步骤S4)具体为：

将所述纯化洗脱液减压浓缩后，用醇水溶液重结晶，得到一叶萩碱。

优选的，所述醇水溶液中醇溶剂与水的体积比为(1：2)～(4：5)。

本发明提供了一种高纯度单体一叶萩碱的分离纯化方法，包括以下步骤：S1)将一叶萩用醇提取，得到提取液；S2)将所述提取液经反相聚合物色谱填料吸附后，洗脱，得到洗脱液；S3)将所述洗脱液经硅胶柱层析色谱纯化后，得到纯化洗脱液；S4)将所述纯化洗脱液重结晶，得到高纯度单体一叶萩碱。与现有技术相比，本发明工艺简单，成本低，且可直接得到一叶萩碱无需经碱化处理，使产品收率与纯度均较高。

附图说明

图1为原料一叶萩的HPLC谱图；

图2为本发明实施例1中得到的一叶萩碱的HPLC谱图；

图3为本发明实施例2中得到的一叶萩碱的HPLC谱图；

图4为本发明实施例3中得到的一叶萩碱的HPLC谱图；

图5为本发明实施例4中得到的一叶萩碱的HPLC谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种高纯度单体一叶萩碱的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1)将一叶萩用醇提取，得到提取液；

S2)将所述提取液经反相聚合物色谱填料吸附后，洗脱，得到洗脱液；

S3)将所述洗脱液经硅胶柱层析色谱纯化后，得到纯化洗脱液；

S4)将所述纯化洗脱液重结晶，得到高纯度单体一叶萩碱。

按照本发明，优选先将一叶萩粉碎，然后再用醇提取，得到提取液；所述粉碎的程度优选为2～5mm的段；所述醇为本领域技术人员熟知的醇即可，并无特殊的限制，本发明中优选为乙醇和/或甲醇，更优选为体积分数为95％的乙醇和/或体积分数为95％的甲醇；所述一叶萩与醇的质量体积比优选为1g:(3～5)ml；所述提取的温度优选为70℃～90℃，更优选为75℃～85℃，再优选为80℃；所述提取的时间优选为1～2h；为提高提取产率，优选提取3～8次，更优选提取4～6次，最优选提取5次，将各次的提取液合并。

在本发明中，优选先将提取液浓缩；所述浓缩的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明优选采用减压浓缩；所述浓缩的温度优选为50℃～70℃，更优选为55℃～65℃，再优选为60℃；所述浓缩优选至无醇溶剂为止。

浓缩后，用反向聚合物色谱填料吸附；所述反向聚合物色谱填料为本领域技术人员熟知的反向聚合物色谱填料即可，并无特殊的限制，本发明中优选为大孔树脂填料或NM系列色谱填料；所述大孔树脂为本领域技术人员熟 知的大孔树脂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为AB-8大孔树脂或D-101大孔树脂；所述NM系列色谱填料为本领域技术人员熟知的NM系列色谱填料即可，并无特殊的限制，本发明中优选为NM100-反向聚合物色谱填料。

吸附后，优选依次用水、30％～50％的醇溶液洗涤，然后用70％～90％的乙醇洗脱，得到洗脱液；所述醇溶液为本领域技术人员熟知的醇溶液即可，并无特殊的限制，本发明中优选为甲醇溶液和/或乙醇溶液。其中，在本发明中如无特殊说明百分数均为体积百分数，如30％～50％的醇溶液为醇体积分数为30％～50％的醇溶液。

将所述洗脱液用硅胶柱层析色谱纯化，具体优选按照以下步骤进行：将洗脱液减压浓缩后，用硅胶拌样，得到过柱原料；用有机溶剂与醇溶剂对过柱原料进行梯度洗脱，得到纯化洗脱液；所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯；所述醇溶剂为本领域技术人员熟知的醇溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为甲醇。。

在本发明中，优选将洗脱液减压浓缩至浸膏，然后再用硅胶拌样，得到过柱原料；所述减压浓缩的温度优选为50℃～70℃，更优选为55℃～65℃，再优选为60℃；所述硅胶的目数优选为60～80目；所述浸膏与硅胶的质量比优选为1：(2～4)。

用有机溶剂与醇溶剂对过柱原料进行梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序优选具体为：100％有机溶剂；待杂质基本除净后，有机溶剂与醇溶剂的体积比为(40～60)：1，优选为(45～55)：1，再优选为50：1，得到纯化洗脱液；所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。得到洗脱液后，优选继续进行洗脱，有机溶剂与醇溶剂的体积比为30：1，本段含有少量产品后段，最后有机溶剂与醇溶剂的比例为10：1洗脱，至色带全部洗完，把柱内试剂全部压干，洗脱完成。

将所述纯化洗脱液结晶；所述结晶的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊限制，本发明优选将所述纯化洗脱液减压浓缩后，用醇水溶液重结晶，得到一叶萩碱；所述减压浓缩的温度优选为50℃～70℃，更优选为55℃～65℃，再优选为60℃；所述减压浓缩优选至无有机溶剂；所述醇水溶液中醇溶剂与水的体积比优选为(1：2)～(4：5)；所述醇溶剂为本领域技术人员熟知的醇溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为乙醇。

本发明优选采用高效液相色谱(HPLC)对得到的一叶萩碱进行质量检测；所述高效液相色谱的色谱柱优选为C18色谱柱；所述高效液相色谱的流动相优选为乙腈与乙酸铵水溶液；所述乙腈与乙酸铵水溶液的体积比优选为30：70；所述乙酸铵的浓度优选为0.04mol/L；所述高效液相色谱的检测波长优选为256nm。

本发明工艺简单，成本低，且可直接得到一叶萩碱无需经碱化处理，使产品收率与纯度均较高。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种一叶萩碱的分离纯化方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

1.1提取:

一叶萩药材粉碎成4mm的段，先用95％乙醇(一叶萩与95％乙醇的质量体积比为1g：4ml)回流提取，提取温度80℃，提取5次，合并提取液，每次提取1h。

提取液浓缩：把提取液于60℃，减压浓缩，浓缩至无醇，收集浓缩液，备用。

1.2富集：

采用反相聚合填料AB-8大孔树脂。

过程：

处理好的浓缩液，上聚合填料进行吸附，过柱液弃去，吸附完成后，先用水洗，然后用50％浓度乙醇进行洗涤，然后用80％乙醇洗脱，收集洗脱液。

1.3纯化：

纯化方法：硅胶柱层析色谱

纯化原料：洗脱液60℃减压浓缩至浸膏，用硅胶(60～80目)拌样，两者质量比为1：3，成黄色的分散颗粒，作为过柱原料。

过柱体系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，先用100％二氯甲烷洗脱，除去原料中小极性杂质，TLC跟踪在线检测，洗脱至产品前沿杂质基本去除干净后，二氯甲烷与甲醇的体积比为50：1洗脱，根据洗脱的色带进行收集，TLC跟踪检测，收集产品段，得到纯化洗脱液；然后用二氯甲烷与甲醇的体积比为 30：1洗脱，本段还有少量产品后段；最后用二氯甲烷与甲醇的比例为10：1的洗脱液洗脱，至色带全部洗完，把柱内试剂全部压干，洗脱完成。

1.4结晶、干燥

收集到的产品段60℃减压浓缩，浓缩至无有机溶剂，所得固体用乙醇水(体积比为1:2)重结晶，最后收得一叶萩碱的纯品，产品纯度达99％以上

质控检测方法：

HPLC条件：C18柱；流动相条件：乙腈-0.04mol/L乙酸铵(30:70)；检测波长：256nm。

图1为原料一叶萩的HPLC色谱图，其结果见表1。

图2为实施例1中得到的一叶萩碱的HPLC色谱图，结果见表2；产品纯度为99.61％，产品收率为82％。

表1一叶萩的HPLC检测结果

说明：13.2min出峰为一叶萩碱的信号峰。

表2一叶萩碱的HPLC检测结果

实施例2

2.1提取:

一叶萩药材粉碎成2mm的段，先用95％乙醇(一叶萩与95％乙醇的质量体积比为1g：5ml)回流提取，提取温度80℃，提取5次，合并提取液，每次提取1h。

提取液浓缩：把提取液于60℃，减压浓缩，浓缩至无醇，收集浓缩液，备用。

2.2富集：

采用反相聚合填料AB-8大孔树脂。

过程：

处理好的浓缩液，上聚合填料进行吸附，过柱液弃去，吸附完成后，先用水洗，然后用50％浓度的醇进行洗涤，然后用90％乙醇洗脱，收集洗脱液。

2.3纯化：

纯化方法：硅胶柱层析色谱

纯化原料：洗脱液60℃减压浓缩至浸膏，用硅胶(60～80目)拌样，两者质量比为1：4，成黄色的分散颗粒，作为过柱原料。

过柱体系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，先用100％二氯甲烷洗脱，除去原料中小极性杂质，TLC跟踪在线检测，洗脱至产品前沿杂质基本去除干净后，二氯甲烷与甲醇的体积比为50：1洗脱，根据洗脱的色带进行收集，TLC跟踪检测，收集产品段，得到纯化洗脱液；然后用二氯甲烷与甲醇的体积比为30：1洗脱，本段还有少量产品后段；最后用二氯甲烷与甲醇的比例为10：1的洗脱液洗脱，至色带全部洗完，把柱内试剂全部压干，洗脱完成。

2.4结晶、干燥

收集到的产品段60℃减压浓缩，浓缩至无有机溶剂，所得固体用乙醇水(体积比4:5)重结晶，最后收得一叶萩碱的纯品，产品纯度达99％以上

质控检测方法：

HPLC条件：C18柱；流动相条件：乙腈-0.04mol/L乙酸铵(30:70)；检测波长：256nm。

图3为实施例2中得到的一叶萩碱的HPLC色谱图，结果见表3；产品纯度为99.98％，产品收率为83％。

表3一叶萩碱的HPLC检测结果

实施例3

3.1提取:

一叶萩药材粉碎成5mm的段，先用95％甲醇溶液(一叶萩与95％乙醇的质量体积比为1g：3ml)回流提取，提取温度80℃，提取5次，合并提取液，每次提取1h。

提取液浓缩：把提取液于60℃，减压浓缩，浓缩至无醇，收集浓缩液，备用。

3.2富集：

采用反相聚合填料NM100-反向聚合物色谱填料。

过程：

处理好的浓缩液，上聚合填料进行吸附，过柱液弃去，吸附完成后，先用水洗，然后用40％浓度的醇进行洗涤，然后用70％乙醇洗脱，收集洗脱液。

3.3纯化：

纯化方法：硅胶柱层析色谱

纯化原料：洗脱液60℃减压浓缩至浸膏，用硅胶(60～80目)拌样，两者质量比为1：2，成黄色的分散颗粒，作为过柱原料。

过柱体系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，先用100％二氯甲烷洗脱，除去原料中小极性杂质，TLC跟踪在线检测，洗脱至产品前沿杂质基本去除干净后，二氯甲烷与甲醇的体积比为50：1洗脱，根据洗脱的色带进行收集，TLC跟踪检测，收集产品段，得到纯化洗脱液；然后用二氯甲烷与甲醇的体积比为30：1洗脱，本段还有少量产品后段；最后用二氯甲烷与甲醇的比例为10：1的洗脱液洗脱，至色带全部洗完，把柱内试剂全部压干，洗脱完成。

3.4结晶、干燥

收集到的产品段60℃减压浓缩，浓缩至无有机溶剂，所得固体用乙醇水(体积比3:5)重结晶，最后收得一叶萩碱的纯品，产品纯度达99％以上

质控检测方法：

HPLC条件：C18柱；流动相条件：乙腈-0.04mol/L乙酸铵(30:70)；检测波长：256nm。

图4为实施例3中得到的一叶萩碱的HPLC色谱图，结果见表4；产品纯度为99.63％，产品收率为85％。

表4一叶萩碱的HPLC检测结果

实施例4

4.1提取:

一叶萩药材粉碎成4mm的段，先用95％甲醇溶液(一叶萩与95％甲醇的质量体积比为1g：3ml)回流提取，提取温度80℃，提取5次，合并提取液，每次提取1h。

提取液浓缩：把提取液于60℃，减压浓缩，浓缩至无醇，收集浓缩液，备用。

4.2富集：

采用反相聚合填料D-101大孔树脂。

过程：

处理好的浓缩液，上聚合填料进行吸附，过柱液弃去，吸附完成后，先用水洗，然后用30％浓度的醇进行洗涤，然后用70％乙醇洗脱，收集洗脱液。

4.3纯化：

纯化方法：硅胶柱层析色谱

纯化原料：洗脱液60℃减压浓缩至浸膏，用硅胶(60～80目)拌样，两者质量比为1：2，成黄色的分散颗粒，作为过柱原料。

过柱体系：二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，先用100％二氯甲烷洗脱，除去原料中小极性杂质，TLC跟踪在线检测，洗脱至产品前沿杂质基本去除干净后，二氯甲烷与甲醇的体积比为50：1洗脱，根据洗脱的色带进行收集，TLC跟踪检测，收集产品段，得到纯化洗脱液；然后用二氯甲烷与甲醇的体积比为30：1洗脱，本段还有少量产品后段；最后用二氯甲烷与甲醇的比例为10：1的洗脱液洗脱，至色带全部洗完，把柱内试剂全部压干，洗脱完成。

4.4结晶、干燥

收集到的产品段60℃减压浓缩，浓缩至无有机溶剂，所得固体用乙醇水(体积比4:5)重结晶，最后收得一叶萩碱的纯品，产品纯度达99％以上

质控检测方法：

HPLC条件：C18柱；流动相条件：乙腈-0.04mol/L乙酸铵(30:70)；检测波长：256nm。

图5为实施例4中得到的一叶萩碱的HPLC色谱图，结果见表5；产品纯度为99.68％，产品收率为80％。

表5一叶萩碱的HPLC检测结果