专利名称：一种分离胰岛素单体和多聚体的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离胰岛素单体和多聚体的方法，属于仪器分析领域。
背景技术：
由于胰岛素具有自我缔合的特性。在不同的PH、温度、离子强度等条件下，它能以单体、 二聚体、四聚体、六聚体或更高的聚集态存在。胰岛素是一种变构蛋白，去锌胰岛素在很大的浓度范围内以二聚体和四聚体的形式存在，较难以单体或六聚体存在。含两个Zn2+的胰岛素在很大的浓度范围内以二聚体和六聚体的形式存在，其所含的锌离子对六聚体复合物的稳定性和动力学性质影响很大。在大多数溶液或胰岛素制剂中，胰岛素主要以六聚体形式存在，只有在浓度极稀(约10_9mol ·Ι^)，小于临界聚集浓度的生理条件下，胰岛素才完全解聚以单体活性形式存在。在中性pH7.0时，两个邻近的胰岛素单体的B-M和B-沈之间通过氢键形成二聚体，三个二聚体能聚集成六聚体，锌离子可加速六聚体形成，此时单体的含量小于0. 1%。因其不同聚集态的分子量的不同，利用电泳技术可将其分离成分子量大小不同的条带。但常规电泳的分离分子量范围有限，很难分离出胰岛素这类小分子蛋白的单体。与普通凝胶电泳相比，梯度凝胶电泳的优点在于蛋白质在梯度凝胶中迁移，经过的孔径越来越小，直到凝胶的孔径不能通透，这样蛋白质就被浓缩，集中在一个很窄的区带中。利用这一很窄的区带，可以分辨出小分子量及分子量相差较小的蛋白质(胰岛素的分子量约为 6KD)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离胰岛素单体和多聚体的实验方法。本发明的分离胰岛素单体和多聚体的方法，包括下列步骤
(1)配置磷酸盐缓冲液(PB)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris-HCl溶液和NaCl溶液，浓度均为 100-500mmol/L, pH 均为 4-8 ；
(2)称取4份一定量的胰岛素，分别溶于一定体积步骤(1)得到的四种溶液中，制成胰岛素含量为0. 5-2mg/ml的4种样品，使其充分溶解，分装保存；
(3)步骤(2)所得的四种胰岛素溶液中加入一定量的锌和苯酚作为稳定剂，使胰岛素、 锌和苯酚三者摩尔比为1: (21000 22000) (140 160)。(4)微量注射针上样，进行梯度凝胶电泳，恒压100 200v电泳30min 120min。为了进一步鉴定所分离开的胰岛素单体和多聚体，还要包括如下步骤
(5)配制考马斯亮蓝或银染显色的各种试剂，进行凝胶染色；
(6)凝胶成像系统照相。步骤(2)中，对4种样品，使用微型混合仪混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解。步骤(3)中，稳定剂锌和苯酚的配制条件为分别用去离子水溶解一定量的易溶于水的分析纯锌盐和苯酚，最后定容，使得加入胰岛素溶液前，锌离子的浓度范围为 0. 25 7. 5g/ml，苯酚的浓度范围为1 5mg/ml。梯度电泳使用质量体积浓度1 20%的聚丙烯酰胺梯度凝胶，冷却电泳槽至10°C以下，并预电泳25min 45min。本发明以胰岛素为实验对象，分离和鉴定其单体、二聚体、六聚体等各种存在形式，其有益效果在于
(1)为进一步研究胰岛素与糖尿病及阿尔茨海默症的关系奠定了实验基础；
(2)探讨了磷酸根离子对胰岛素单体或多聚体存在形式的影响；
(3)为除胰岛素以外的其它蛋白质多聚体的分析研究、蛋白的磷酸化和去磷酸化研究、 阿尔茨海默症等蛋白质错误折叠疾病的诊断与防治找出新的药物干预手段等提供了新的思路；
(4)原材料来源广泛，价格低廉，而梯度凝胶虽然价格较贵，但一次可上10个样，对总体价格影响不太大，实验方法简单易操作。
图1 Bis-Tris梯度胶电泳分离Img · πιΓ1胰岛素在相同ρΗ7. 4，不同溶液介质中的胰岛素单体和多聚体电泳图谱(采用考马斯亮蓝染色法)。图2 Bis-Tris梯度胶电泳分离Img · πιΓ1胰岛素在相同ρΗ7. 4，不同溶液介质中的胰岛素单体和多聚体电泳图谱(采用银染染色法)。具体实施方法
下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明不局限于下述实施例。实施例1 1.试剂和仪器
商品化的胰岛素，4%_20%的NuPAGE Novex Bis-Tris预制凝胶，SeeBlue Plus2预染标准蛋白(IX)(蛋白Marker)，NuPAGE十二烷基硫酸锂样品溶液GX) (LDS)，十二烷基硫酸钠(SDS)，三羟甲基氨基甲烷(1Tris-base )，2_ (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)，乙二酰四乙酸 (EDTA)，考马斯亮蓝 R-250, NaH2PO4 · 2H20, Na2HPO4 · 12H20, NaCl，KH2PO4, HCl，NaOH 等均为国产分析纯。微型梯度电泳槽、摇床、PH计、电泳仪、微型漩涡混合仪、电子分析天平、凝胶成像系统。2.溶液的配制 (1) IOOmmol/L 的 PB
A 液为 100mmol/L 的 NaH2PO4 · 2H20 称取 1. 5600 g NaH2PO4 · 2H20，加去离子水定容至 IOOml ；
B 液为 IOOmmol/L 的 Na2HPO4 · 12H20 称取 2. 2460 g Na2HPO4 · 12H20，加去离子水定容至 100ml。将19ml的A液与81ml的B液混合后即成IOOmmol/L PB0(2) 100mmol/L 的 PBS
称取 8. OOOOgNaCl，0. 2000gKCl, 1. 4400g Na2HPO4 和 0. 2400gKH2P04,加去离子水定容至 100ml。(3) 1 OOmmo 1/L 的 Tris-HCl
① IOOmmol/L 的 Tris base 称取 1. 2100g Tris base 用去离子水定容至 100ml。
②100mmol/L的HCl (IOOml)用移液管吸取0. 85ml浓HC1，加去离子水定容至 100ml。将IOOmmol/L HCl缓慢加入到IOOmmol/L Tris base中，边加边调PH值至7. 4，即为 100mmol/L 的 Tris-HCl。(4) IOOmmol/L 的 NaCl 溶液
称取分析纯NaCl 0. 6000g,用去离子水定容至100ml，其摩尔浓度为100mmol/L。(1) (2) (4)均用 10mmol/L 的此1、100讓01/1妝0!1，使用？!1计调节？!1值至7.4。(5) 20XNuPAGE SDS 电泳缓冲液的配制(贮备液)
称取 9. 7600g MES, 6. 0600g Tris base, 1. OOOOg SDS，0.3000g EDTA，加超纯水定容至 50ml (电泳前加950ml超纯水即成1 X NuPAGE SDS电泳缓冲液)。(6)考马斯亮蓝染色试剂
①固定液(200ml)甲醇100ml，乙酸20ml，加去离子水定容至200ml。②考马斯亮蓝染色液(200ml):甲醇100ml，考马斯亮蓝R-250 0. lOOOg，乙酸 20ml，加去离子水定容至200ml，在加乙酸和超纯水之前将R-250溶于甲醇。③脱色液(500ml)乙酸35ml，甲醇25ml，加去离子水定容至500ml。3.胰岛素样品溶液的制备
称取4份0. OOlOg的胰岛素，分别溶于Iml上述四种溶液中，制成胰岛素含量为Img/ ml的4种样品，使用微型混合仪混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解，然后四种胰岛素溶液中各加入一定量的稳定剂锌和苯酚，使胰岛素、锌和苯酚三者的物质的量摩尔比为 1:21000:140。4.胰岛素蛋白梯度电泳步骤
(1)将NuPAGE预制胶从包装袋拿出来，用去离子水冲洗凝胶，撕掉凝胶底部的胶带，轻轻拔掉凝胶上部的梳子；
(2)用移液器吸取一定量IXNuPAGE SDS电泳缓冲液冲洗上样孔2_3遍，倒置凝胶， 将电泳缓冲液轻轻甩出(必要时用滤纸吸干)；
(3)定向2块凝胶，使其上样孔(即低的一面)朝向缓冲区核心，将凝胶插入电泳槽底部， 向里推动张力楔，固定凝胶；
(4)在电泳槽中央仓倒入少量电泳缓冲液，检查槽的封闭紧密性。如果发现电泳缓冲液从中央仓向外泄露，倒掉电泳缓冲液，重新检漏，重新装配装置；
(5)检漏完成后，将IX电泳缓冲液倒入电泳槽中央仓，装满。缓冲液要漫过上样孔，冷却装置(即将电泳槽置于装满冰块的容器里)，预电泳25 min.
(6)胰岛素溶液样品上样量为5μ1 (所有样品上样前均经过500-1000rpm离心处理 5-15min)，蛋白 Marker 上样量为 10 μ 1 ；
(7)在中央仓外的槽倒入适量的IX电泳缓冲液，约600ml；
(8)冷却装置，恒压200v电泳35min；
(9)电泳完后，用镊子小心地从四周撬开凝胶塑料板，取出凝胶。5.蛋白染色(考马斯亮蓝染色)
(1)将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以3-5倍的固定液覆盖，在旋转摇床中缓慢摇动2h。(2)倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶，并缓慢摇动4h。(3)倾去染色液，用约50ml固定液冲洗凝胶。(4)倾去固定液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动，倾去脱色液，再加入新脱色液同时至获得蓝色条带及干净的背景(换液3-4次，脱色过夜可脱得比较干净)。凝胶可放置在7% 乙酸或水中保存。(5) Bio-Profil凝胶成像系统给凝胶拍照(见图1)。图谱中以PB、PBS溶液为溶解介质的胰岛素样品出现了胰岛素单体条带，以Tris-HCl溶液为溶解介质的胰岛素样品出现了胰岛素二聚体条带，以生理盐水为溶解介质的胰岛素样品中出现三聚体条带(因未见有关胰岛素三聚体的文献报道，故不确定该条带是三聚体还是四聚体)，本实验结果说明不同溶液介质中胰岛素多聚体存在稳定性的差别，同时也证明了磷酸根离子具有抑制胰岛素聚集成多聚体的作用。实施例2 1.试剂和仪器
商品化的胰岛素，4%_18%的NuPAGE Novex Bis-Tris预制凝胶，SeeBlue Plus2预染标准蛋白(IX)，NuPAGE十二烷基硫酸锂样品溶液GX) (LDS)，十二烷基硫酸钠(SDS)， 三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)，乙二酰四乙酸(EDTA)JIHf 硫酸钠(Νει2&03)，硝酸银(AgNO3), K2CO3, NaH2PO4 · 2H20, Na2HPO4 · 12H20, NaCl，KH2PO4, HCl， NaOH等均为国产分析纯。微型梯度电泳槽、摇床、PH计、电泳仪、微型漩涡混合仪、电子分析天平、凝胶成像系统。2.溶液的配制
(1) 500mmol/L 的 PB
A 液为 500mmol/L 的 NaH2PO4 · 2H20 称取 7. 8000 g NaH2PO4 · 2H20，加去离子水定容至 100ml。B 液为 500mmol/L 的 Na2HPO4 · 12H20 称取 11. 2300 g Na2HPO4 · 12H20,加去离子水定容至100ml。将19ml的A液与81ml的B液混合后即成500mmol/L PB。(2) 500mmol/L 的 PBS
称取 40. OOOOgNaCl，1. OOOOgKCl，7. 2000g Na2HPO4 和 1. 2000gKH2P04，加去离子水定容至 100ml。(3) 500mmol/L 的 Tris-HCl
① 500mmol/L 的 Tris base 称取 6. 0500g Tris base 用去离子水定容至 100ml。②500mmol/L的HCl (100ml)用移液管吸取4. 25ml浓HC1，加去离子水定容至 IOOml
将500mmol/L HCl缓慢加入到500mmol/L Tris base中，边加边调PH值至7. 4，即为 500mmol/L 的 Tris-HCl。(4) 500mmol/L 的 NaCl 溶液
称取分析纯NaCl 3. OOOOg,用去离子水定容至100ml，其摩尔浓度为500mmol/L。
(1) (2) (4)均用 10mmol/L 的 HC1、10(toimol/L 的 NaOH，使用 pH 计调节 pH 值至
7. 4。(5) 20X NuPAGE SDS电泳缓冲液的配制(贮备液)
称取 9. 7600g MES, 6. 0600g Tris base, 1. OOOOg SDS，0.3000g EDTA，加超纯水定容至 50ml (电泳前加950ml超纯水即成1 X NuPAGE SDS电泳缓冲液)。(6)银染试剂
①凝胶固定液(500ml)甲醇200ml，醋酸50ml，加超纯水定容至500ml。②敏化液(200ml)=Naj2O3 0. 0400g，加超纯水定容至 200ml。③染色液(200ml) =AgNO3 0. 4000g，加超纯水定容至200ml，福尔马林0.(临用前加)。④显色液(200ml)=K2CO36. OOOOg, Na2S2O3 2. 5000g,加超纯水定容至 200ml，福尔马林0. 13細1(临用前加)。⑤终止液(200ml) :Tris base 6g，醋酸20ml，加超纯水定容至200ml。3.胰岛素样品溶液的制备
称取4份0. OOlOg的胰岛素，分别溶于Iml上述四种溶液中，制成胰岛素含量为lmg/ml 的4种样品，使用微型混合仪混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解。4.胰岛素蛋白梯度电泳步骤
(1)将NuPAGE预制凝胶1从包装袋拿出来，用去离子水冲洗凝胶，撕掉凝胶底部的胶带，轻轻拔掉凝胶上部的梳子；
(2)用移液器吸取一定量IXNuPAGE SDS电泳缓冲液冲洗上样孔2_3遍，倒置凝胶， 将电泳缓冲液轻轻甩出(必要时用滤纸吸干)；
(3)定向2块凝胶，使其上样孔(即低的一面)朝向缓冲区核心，将凝胶插入电泳槽底部， 向里推动张力楔，固定凝胶；
(4)在电泳槽中央仓倒入少量电泳缓冲液，检查槽的封闭紧密性。如果发现电泳缓冲液从中央仓向外泄露，倒掉电泳缓冲液，重新检漏，重新装配装置；
(5)检漏完成后，将IX电泳缓冲液倒入电泳槽中央仓，装满。缓冲液要漫过上样孔，冷却装置(即将电泳槽置于装满冰块的容器里)，预电泳45 min.
(6)胰岛素蛋白上样量为20μ 1，蛋白Marker上样量为15μ 1 ；
(7)在中央仓外的槽倒入适量的IX电泳缓冲液，约600ml；
(8)冷却装置，恒压IOOv电泳90min；
(9)电泳完后，用镊子小心地从四周撬开凝胶塑料板，取出凝胶。5.蛋白染色(银染)
(1)将凝胶置于塑料容器中，加入50ml甲醛固定液，在旋转摇床中缓慢摇动lOmin。(2 )倾去固定液，用纯净水洗2次，每次5min，缓慢摇动。(3)倾去水，凝胶浸泡在0. 2g/L硫代硫酸钠溶液中Imin，缓慢摇动。(4)倾去硫代硫酸钠溶液，用纯净水洗凝胶2次，每次20s。(5)倾去水，将凝胶浸泡在50ml 0. 1%硝酸银中lOmin，缓慢摇动。(6)倾去硝酸银溶液，用纯净水洗胶，然后用小量体积的硫代硫酸钠显影液洗。(7)将凝胶浸泡在50ml新配制的硫代硫酸钠显影液中，缓慢摇动，直至获得足够的条带显色强度(约lmin)，在下一步停影前继续显影一会儿，或显影到此为止。(8)每IOOml硫代硫酸钠显影液加入5ml 2. 3mol/L柠檬酸，缓慢摇动lOmin。(9)倾去液体，用纯净水洗凝胶，缓慢摇动lOmin。(10)倾去水，将凝胶浸泡在50ml干胶液中lOmin。(11)将凝胶放在2张湿润的透析膜之间，夹在玻璃平板中，平板中边缘用夹子夹好，在室温干燥过夜，次日用凝胶成像系统照相；或将胶保存在去离子水中，做完银染后立即用凝胶成像系统照相(见图2)。图片经过反相处理，胰岛素在四种溶液介质(PB、PBS、 TriS-HCl、NaCl)中均有单链( 3KD)条带出现，提示胰岛素有可能被解链；胰岛素在PB溶液中电泳出现的条带比其它三种溶液(PBS、Tris-HCl, NaCl)多一条带，即为胰岛素二聚体 ( 12KD)的条带。表明胰岛素在PB溶液介质中除大量存在胰岛素单体外，也有少量的二聚体存在。在其它三种溶液中的胰岛素则主要以单体形式存在。讨论
实施例1显示出了不同溶液介质中胰岛素多聚体存在稳定性的差别，同时也证明了磷酸根离子具有抑制胰岛素聚集成多聚体的作用，而实施例2中没有体现出这些区别；此外实施例1采用考马斯亮蓝染色法，出现的条带清晰、明了，实施例2采用银染法出现的条带较模糊，虽然银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色法要高，但由于银染实验步骤繁多且对实验操作的要求也极高，故本实验采用考马斯亮蓝染色法足以。
权利要求
1.一种分离胰岛素单体和多聚体的方法，包括下列步骤(1)配置磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、TriS-HCl溶液和NaCl溶液，浓度均为100— 500mmol/L，pH 均为 4一8 ；(2)称取4份一定量的胰岛素，分别溶于一定体积步骤(1)得到的四种溶液中，制成胰岛素含量为0. 5—2mg/ml的4种样品，分装保存；(3)步骤(2)所得的四种胰岛素溶液中加入一定量的锌和苯酚作为稳定剂，使胰岛素、 锌和苯酚三者摩尔比为1: (21000 22000) (140 160);(4)微量注射针上样，进行梯度凝胶电泳，恒压100 200v电泳35min 90min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，对4种样品，使用微型混合仪混合15min，37°C水浴lOmim，使其充分溶解。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，稳定剂锌和苯酚的配制条件为分别用去离子水溶解一定量的易溶于水的分析纯锌盐和苯酚，最后定容，使得加入胰岛素溶液前，锌离子的浓度范围为0. 25 7. 5g/ml，苯酚的浓度范围为1 5mg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，梯度电泳使用质量体积浓度m 20% 的聚丙烯酰胺梯度凝胶，冷却电泳槽至10°C以下，并预电泳25min 45min。
全文摘要
本发明运用梯度电泳分离胰岛素单体和多聚体，其中在胰岛素样品溶液中加入了稳定剂锌和苯酚，使胰岛素、锌和苯酚三者摩尔比为1:(21000～22000):(140～160)。本实验成功地建立了分离胰岛素单体与多聚体梯度电泳检测分析方法，为进一步研究胰岛素与糖尿病及阿尔茨海默症的关系奠定了实验基础，同时为除胰岛素以外的其它蛋白质多聚体的分析研究、蛋白的磷酸化和去磷酸化研究、阿尔茨海默症等蛋白质错误折叠疾病的诊断与防治找出新的药物干预手段等提供了新的思路。
文档编号C07K1/26GK102276686SQ201110202209
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者田卫群, 胡巧琳 申请人:武汉大学