一种提取胰岛素的方法
【专利摘要】本发明阐述一种提取胰岛素的方法。本发明的技术方案采取酸醇液法破坏胰脏，来提取胰岛素，然后根据等电点沉淀的原理，调节pH，碱化、酸化除杂蛋白，减压浓缩进一步提纯并除去乙醇，最后加热去脂，氯化钠盐析制得胰岛素。本法每千克胰脏可得4g以上胰岛素。
【专利说明】—种提取胰岛素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域，设计药用胰岛素的生化分离技术。具体地说是采用酸醇提取减压浓缩法提取动物胰脏中的胰岛素。
【背景技术】
[0002]胰岛素是哺乳动物胰岛β细胞分泌的蛋白性激素，分子中含有以二硫键相连接的两条多肽链。胰岛素可溶于80%以下的稀醇、稀丙醇及酸、碱中，不溶于90%以上的乙醇及其他有机溶剂，在PH值为2~4时较稳定，遇蛋白酶、强酸、强碱易被破坏，加热易变性，其等电点为5.3~5.4。 [0003]胰岛素可以调节糖代谢，减少糖原异生，促进糖原合成，抑制糖原分解，加速葡萄糖的无氧酵解和有氧氧化，促进组织对葡萄糖的利用，并能促进葡萄糖转变为脂肪，因而可降低血糖。
[0004]糖尿病是世界上最常见的代谢疾病之一，据国际糖尿病联盟2011年公布的最新数据显示，全球糖尿病患病人数已达到3.66亿。临床糖尿病患者多使用胰岛素疗法以维持血糖的正常水平。近年来人胰岛素在临床上也得到了广泛的应用。目前，应用基因工程和蛋白水解酶的转肽方法已成功地生产出人胰岛素。基因工程方法生产人胰岛素投资大，工艺复杂。
[0005]传统生产工艺从从动物(猪)提纯胰岛素，采用酸-醇液将其萃取分离，通过盐析将其析出后进行分离纯化。结果:去除杂质蛋白、阴阳离子、热原性物质等，可得到胰岛素。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是为了提高胰岛素的收率，对传统工艺加以改造，控制好酸-醇萃取液的碱化、酸化PH值，得到了一种改良的从动物胰脏中提取胰岛素的方法，该方法包括如下步骤:
[0007](I)原料预处理:胰脏离体后，要立即深冻，先在-20~_40°C下急冻后转入-15~28°C°C保存备用。
[0008](2)酸醇液提取:胰脏冻干粉碎后加入2.0~3.0倍量的酸性乙醇用冰乙酸调PH2.0~3.2，乙醇含量为60%~75%，在8~15°C搅拌提取3h，离心，取上清液。滤渣再用1.0~2.0倍量酸性乙醇同上述方法提取。合并两次提取液。
[0009](3)碱化、酸化:提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH7.8~8.5(液温10~15°C )，立即进行压滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至PH3.5~3.8，降温至4~5°C，静置4~8h，使酸性蛋白充分沉淀。
[0010](4)减压浓缩:吸上层清液至减压浓缩锅内，下层过滤，沉淀物弃去。滤液并入上清液，在30°C以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04~1.06(约为原体积的I /10~I / 9为止)。
[0011](5)去脂、盐析:浓缩液转入去脂锅内于5min内加热至48~55°C后，立即用冰盐水降温至4~5°C，静置3~4h，分离出下层清液。用盐酸调pH2.3~2.5，于20~25°C在搅拌下加入0.25~0.3倍量固体氯化钠，保温静置3~8h，析出沉淀。
[0012](6)洗涤、干燥:过滤，沉淀用丙酮洗涤三次，10~30°C真空干燥，得胰岛素，称重。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
[0014]采用酸醇提取减压浓缩法提取动物胰脏中的胰岛素，可以提高提取胰岛素的效率，并且使其理化性质和生物活性保持稳定，从而有利于下一步对胰岛素进行精制，最终使胰岛素的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得胰岛素收率提高到0.4%~0.6%，节约成本，提高了经济效益。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0016]实施例1
[0017](I)原料预处理:胰脏离体后，要立即深冻，先在_30°C以下急冻后转入_20°C保存备用。
[0018](2)酸醇液提取:取冻干胰块4kg，用刨胰机刨碎后加入11.2L的酸性乙醇(酸性乙醇控制含量为68%，并用冰乙酸调pH2.5)，，在12°C搅拌提取3h，离心，取上清液10.1L。滤渣再用10.1L酸性乙醇同上述方法提取lh，离心，取上清液。合并两次提取液。
[0019](3)碱化、酸化:提取液在不断搅拌下加入浓氨水调PH8.0(液温12°C )，立即进行压滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至PH3.6，降温至5°C，静置4h，使酸性蛋白充分沉淀。
[0020](4)减压浓缩:吸上层清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去。滤液并入上清液，在20°C下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04(约为原体积的I / 10)。
[0021](5)去脂、盐析:浓缩液转入去脂锅内与5min内加热至50°C后，立即用冰盐水降温至5°C，静置4h，分离出下层清液。用盐酸调pH2.3，于20°C在搅拌下加入0.25倍量固体氯化钠，保温静置4h，析出沉淀。
[0022](6)洗涤、干燥:过滤，沉淀用丙酮洗涤三次，20°C真空干燥，得胰岛素，称重20.4g0
[0023]实施例2
[0024](I)原料预处理:胰脏离体后，要立即深冻，先在_35°C以下急冻后转入_15°C保存备用。
[0025](2)酸醇液提取:取冻干胰块4kg，用刨胰机刨碎后加入9.2L的酸性乙醇(酸性乙醇控制含量为75%，并用冰乙酸调pH2.9)，，在10°C搅拌提取3h，离心，取上清液7.95L。滤渣再用7.95L酸性乙醇同上述方法提取lh，离心，取上清液。合并两次提取液。
[0026](3)碱化、酸化:提取液在不断搅拌下加入浓氨水调PH8.3(液温10°C )，立即进行压滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至PH3.4，降温至4°C，静置6h，使酸性蛋白充分沉淀。
[0027](4)减压浓缩:吸上层清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去。滤液并入上清液，在20°C下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.06(约为原体积的I / 9)。
[0028](5)去脂、盐析:浓缩液转入去脂锅内与5min内加热至55°C后，立即用冰盐水降温至4°C，静置6h，分离出下层清液。用盐酸调pH2.5，于20°C在搅拌下加入0.28倍量固体氯化钠，保温静置6h，析出沉淀。
[0029](6)洗涤、干燥:过滤，沉淀用丙酮洗涤三次，20°C真空干燥，得胰岛素，称重19.2g0
[0030]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与`改型`，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种提取胰岛素的方法，其特征在于，包括以下步骤:(I)原料预处理；(2)酸醇液提取；⑶酸化、碱化；⑷减压浓缩；(5)去脂、盐析。
2.权利要求1所述制备方法，其特征在于，各步骤具体为: (1)原料预处理:胰脏离体后，立即深冻。 (2)酸醇液提取:胰脏冻干粉粹后，加入酸性乙醇搅拌提取，离心，取上清液。滤渣再用上述方法提取。合并两次提取液。 (3)碱化、酸化:提取液加入浓氨水调pH，压滤，除去碱性蛋白，滤液用硫酸酸化，降温，静置，使酸性蛋白充分沉淀。 (4)减压浓缩:吸上层清液至减压浓缩锅内，下层过滤，沉淀物弃去。滤液并入上清液，减压蒸去乙醇，浓缩 。 (5)去脂、盐析:浓缩液加热降温去脂。用盐酸调pH，加入0.25~0.3倍量固体氯化钠，保温静置，析出沉淀。 (6)洗涤、干燥:过滤，沉淀用丙酮洗涤，真空干燥，得胰岛素。
3.根据权利要求2所述的一种提取胰岛素的方法，其特征在于，所述胰脏为羊胰脏。
4.根据权利要求2所述的一种提取胰岛素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，胰脏采用-20~_40°C速冻法，贮存温度为-15~28°C。
5.根据权利要求2所述的一种提取胰岛素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中酸醇液pH为2.0~2.9，乙醇含量为60%~75%，搅拌温度为8~15°C。
6.根据权利要求2所述的一种提取胰岛素的方法，其特征在于，所述步骤(3)中碱化pH为7.8~8.5，酸化pH为3.4~3.8。
7.根据权利要求2所述的一种提取胰岛素的方法，其特征在于，所述步骤(4)中采用减压浓缩法蒸去乙醇，温度为25~35°C。
8.根据权利要求2所述的一种提取胰岛素的方法，其特征在于，所述步骤(5)中浓缩液加入去脂锅内迅速加热降温去脂，加热去脂的温度为:45~52°C。
9.根据权利要求2所述的一种提取胰岛素的方法，其特征在于，所述步骤(6)中采用电热真空干燥箱进行干燥。
【文档编号】C07K1/14GK103739702SQ201310643508
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月30日 优先权日:2013年11月30日
【发明者】刘乃山, 安迪, 刘君, 李静洁, 张元泽 申请人:青岛康原药业有限公司