一种斜生栅藻藻株及其分离纯化方法、培养方法及应用
【专利摘要】一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5?2%琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2～4次后得到纯净的单一藻落。一种斜生栅藻藻株SoHNCJ2的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的N或P浓度降低到原来的1/4或增加到原来的三倍，即采用1/4 N或3倍N、P浓度的BG11培养基。本发明的斜生栅藻能够在较低浓度的N源条件下持续快速生长，藻细胞能够有效积累大量油脂，可进行转脂化生产生物柴油。CCTCC NO：M 201625320160506
【专利说明】
_种斜生栅藻藻株及其分禹纯化方法、培养方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物和生物能源领域，尤其是涉及一种斜生栅藻藻株及其分离纯 化、培养、收集方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 随着社会经济的日益繁荣，人类可利用资源日渐枯竭，为了社会的可持续发展，当 今世界各国政府及有关技术人员逐渐将研究方向转向了可再生能源。
[0003] 因为地球上的藻类资源物种丰富，其中不乏富油藻种。因此从油藻中提取油脂用 于生物柴油的生产，以代替日渐枯竭的石油来源，成为科学界十分关注的课题。而现有技术 已有富油藻类的培养提取方法及其有关应用公开，但对于其丰富应用而言，仅仅是九牛一 毛。因此，对这类技术的研究仍在不断地持续深入和扩大中，尚有大量的富油藻类物种，需 要去发现，需要去实现有效的培养和分离，需要去进行深入的应用研究。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术不足，提出了一种斜生栅藻藻株的分离纯化和培养方法，并 对其应用进行了研究。从野外采集水样，通过培养、分离、纯化得到一种斜生栅藻藻株 皿AS oWigut/s)，并进行了保藏，其保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016253,分 类命名：5^/360^5皿/s SoHNCJ2,保藏日期为2016年5月6日，保藏单位为中国典 型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学。
[0005] 本发明所采用的技术方案： 一株斜生栅藻藻株S0HNCJ2,其保藏编号为CCTCC N0:M2016253,保藏日期为2016年5 月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
[0006]
[0007] -种如上所述的斜生栅藻藻株SoHNCJ2的分离纯化方法，1)将采集的水样稀释后 均匀涂布在1.5-2%琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养;2)待平 板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养;3)再将所得划短线培养 的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释涂平板的方法进一步纯化藻 种;4)挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2~4次后得到纯净的单一藻落;所 述培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。
[0008] 一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基8611的咐农度降低到原 来的1/4,即采用1/4N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：
[0009] NaN03,0.375g
[0010] K2HP04,0.04g
[0011] MgS〇4.7H2〇,0.075g
[0012] CaCl2.7H20,0.036g
[0013] Na2C03,0.02g
[0014] 朽1 檬酸，0.006g
[0015] 柠檬酸铁，0.006g
[0016] 微量元素溶液，A5 lmL
[0017] 采用蒸馏水定容至1000mL。
[0018] 一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基8611的咐农度增加到原 来的三倍，即采用3对农度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：
[0019] NaN03,4.5g
[0020] K2HP〇4,0.04g
[0021] MgS〇4.7H20,0.075g
[0022] CaCl2.7H20,0.036g
[0023] Na2C〇3,0.02g
[0024] 柠檬酸，0.006g
[0025] 柠檬酸铁，0.006g
[0026] 微量元素溶液，A5 lmL
[0027] 采用蒸馏水定容至1000mL。
[0028] 一种如上所述的斜生栅藻的培养方法，将淡水蓝藻培养基BG11的P浓度增加到原 来的三倍，即采用3P浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如下：
[0029] NaN03，1.5g
[0030] K2HP〇4,0.12g
[0031] MgS〇4.7H20,0.075g
[0032] CaCl2.7H20,0.036g
[0033] Na2C〇3,0.02g
[0034] 柠檬酸，0.006g
[0035] 柠檬酸铁，0.006g
[0036] 微量元素溶液，A5 lmL
[0037] 采用蒸馏水定容至1000mL。
[0038] 所述的斜生栅藻的培养方法，使藻株在温度15~40°C，光强500~25001ux，pH7-9 的条件下生长，培养至对数生长后期，藻细胞在6~12h内完全自然沉降，倒出上层的培养 基，即得到高浓度的藻液。
[0039]所述的斜生栅藻藻株S〇HNCJ2,其在1/4N BG11培养基中大量培养，生长不受影响， 油脂含量最高，获得的含油藻细胞在转脂化生产生物柴油中的应用。
[0040]所述的斜生栅藻藻株S〇HNCJ2,其大量培养获得的斜生栅藻S〇HNCJ2的多不饱和脂 肪酸含量较高，用于动物饲料的添加。
[0041 ]所述的斜生栅藻藻株SOHNCJ2,其在3N和3P培养基中生长不受影响，其培养方法在 有机污染污水处理中的应用。
[0042]本发明的有益效果：
[0043] 1、本发明的斜生栅藻能够在较低浓度的对原条件下持续快速生长，节约成本。在较 低对农度条件下，藻细胞能够有效积累大量油脂，能够进行转脂化生产生物柴油。
[0044] 2、本发明斜生栅藻藻株S〇HNCJ2的培养方法，藻细胞能够在6~12h内自然沉降，无 需添加絮凝剂，收集方法简单，节约成本，减少对环境的污染。
[0045] 3、本发明斜生栅藻藻株S〇HNCJ2的培养方法，藻细胞内油脂中多不饱和脂肪酸含 量高，能够作为动物饲料的直接营养添加剂。
[0046] 4、本发明斜生栅藻藻株S〇HNCJ2的培养方法，应用于有机污染污水处理，具有一定 的水体净化效果，可以降低水体的富营养化。因为栅藻对有机污染物具有较强的耐性，因此 可在培养基中添加一定比例的有机污染污水，既净化水体，又减少成本。
【附图说明】
[0047] 图1是本发明分离纯化的藻细胞在高倍显微镜下的藻细胞形态示意图；
[0048]图2是本发明分离纯化的藻株16SrDNA序列的进化树分析；
[0049] 图3是本发明分离纯化藻株在不同对农度下的生长曲线；
[0050] 图4是本发明分离纯化藻株大量培养后自然沉降示意图；
[0051] 图5是本发明分离纯化的斜生栅藻在高N、P浓度中的生长曲线。
【具体实施方式】 [0052] 实施例1 一株斜生栅藻藻株SoHNCJ2,其保藏编号为CCTCC N0:M2016253,保藏日期为2016年5 月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
[0053]
[0054] 实施例2
[0055] -种斜生栅藻藻株S〇HNCJ2的分离纯化方法，包括如下步骤：
[0056] 1)从平顶山市新城区平西湖水库多点采集水样，将采集的水样稀释后均匀涂布在 1.5~2%琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中进行连续光照培养；
[0057] 2)待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养；
[0058] 3)再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用 稀释涂平板的方法进一步纯化藻种；
[0059] 4)挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2~4次后得到较为纯净的单 一藻落。
[0060] 培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。
[0061 ]分离纯化的斜生栅藻藻株SoHNCJ2的鉴定方法：
[0062] 1)藻细胞形态鉴定：
[0063] 藻细胞在在1000倍光学显微镜下进行观察，藻细胞形态见图1所示：藻细胞黄绿 色，呈卵圆形，多为2个细胞成对排列，细胞壁平滑，细胞两端具弯曲的长刺，细胞内有大量 颗粒物，色素体周生，具1个蛋白核。单个细胞大小:长6-8um，宽2-3um，初步鉴定为栅藻。
[0064] 2)16S rDNA分子鉴定：
[0065] 采用CTAB法提取基因组DNA，方法如下：先将2XCTAB在65度预热备用；12000rpm离 心收集1.5mL或更多的生长至对数后期的藻细胞于eppendorf管中；破细胞，加入约100yL的 2 X CTAB及少量石英砂涡旋震荡，再加入约300yL预热的2 X CTAB，置于65度温浴0.5-2h;待 冷却至室温，加入400yL氯仿:异戊醇(24:1)，颠倒混匀乳浊状，12000rpm离心10min，上清转 入新的eppendorf管中，加入1/5体积的5M NaCl和2倍体积的无水乙醇，混勾后-20度沉降。 12000rpm离心10min，弃上清，得到的沉淀加入500yL 70%的乙醇，离心3111；[11，弃上清。得到 的总DNA在超净台晾干后溶于适量体积灭菌水或TE缓冲液中。
[0066] 以藻细胞基因组DNA为模板，通过引物18S-1: W -TGGTTGATCCTGCCAGTAGTC-3 〇和 18S-2: (5' -TGATCCTTCTGCAGGTTCACC-3')进行PCR扩增。50yL的PCR反应体系包括：10 X Taq buffer 5yL、MgCl2 4yL、2.5mM dNTPs lyL、5U/yL的ExTaq酶（Fermentas)0.5yL、引物各 500?111〇1、以1^基因组0嫩。？0?反应过程为:94度预变性61^11，接下来是30个循环(94度3〇86(3， 55度30sec，72度2min)，最后是72度延伸lOmin。
[0067] 扩增得到的PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测扩增得到目的片段后， 再用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶回收试剂盒(Bioflux)回收纯化目的片段。按照 实际盒提供的说明书进行操作，基本过程如下:切下含目的片段的胶条，向其中加入等体积 的Extraction buffer，55度温浴lOmin左右;待样品冷却至室温后转至纯化柱中，6000rpm 离心lmin，倒掉收集管中的废液;再加入500yL Extraction buffer 12000rpm离心lmin，倒 掉收集管中的废液;加入750yL Washing buffer 12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废 液;然后12000rpm离心lmin至Washing buffer除尽；将纯化柱置于干净的1.5mL离心管中， 加入30yL预热的灭菌水或TE缓冲液于纯化柱上，放置lmin后12000rpm离心lmin，回收纯化 的DNA送往上海生工进行测序。测序结果在NCBI上进行Blast分析，鉴定藻株所属的种类。 [0068]分离纯化的藻株的16SrDNA序列（测序结果)如下：
[0069] >SoHNCJ2
[0071]下表为分离纯化的藻株16S rDNA序列比对结果：
[0073]序列比对结果显示，所分离纯化的藻株S〇HNCJ2的16S rDNA序列与斜生栅藻的相 似度最高，达到90 %。
[0074]图2是本发明分离纯化的藻株16S rDNA序列的进化树分析。进化树分析结果表明， 所分离纯化的藻株与斜生栅藻的进化关系最近。
[0075] 实施例3
[0076]本实施例为所述斜生栅藻藻株S〇HNCJ2的规模化培养方法及其用于转脂化生产生 物柴油方法。
[0077] 1.藻细胞的培养
[0078]培养基配方:淡水蓝藻培养基BG11的对农度降低到原来的1 /4，即为1 /4N BG11的培 养基。培养基配方:NaN03，0 · 375g; K2HPO4，0 · 04g; MgS〇4 · 7H20，0 · 075g; CaCl2 · 7H20，0 · 036g; Na2C〇3，0.02g;梓檬酸，0.006g;梓檬酸铁，0.006g;微量元素溶液A5 lmL;将上述各成分米用 蒸馏水定容至l〇〇〇mL。
[0079] 微量元素溶液 A5: H3BO4，2 · 86g; MnCh · 4H20，1 · 8 lg; ZnS〇4，0 · 222g; Na2Mo〇4，0 · 39g; CuS〇4.5H2〇,0.079g;Co(N03)2.6H2〇,49.4g。
[0080] 藻细胞培养温度3(TC，光强20001UX。
[0081 ] 2.1/4N浓度对藻株生长的影响
[0082] 配置1/4N浓度和正常的BG11液体培养基，每500mL三角瓶中装入300nL培养基。藻 种培养至对数生长期后，离心收集洗涤一次后，接种于不同N浓度的培养基中，调整初始0D 值为0.05左右，然后放置于30°C、20001uX的条件下培养，每天摇动两次，每隔三天测定OD730 吸光值。
[0083]图3所示为本发明分离纯化藻株在不同N浓度下的生长曲线。如图3所示，N浓降低 不影响藻细胞的生长速率，藻细胞持续对数生长，说明斜生栅藻能够耐受较低N浓度，在大 规模培养时节约对原，降低成本。
[0084] 3.藻细胞的收集
[0085]如图4所示藻细胞在6_12h内能够完全沉降，因此所采用的收集方法为自然沉降， 收集方法简单，无需添加任何絮凝剂。
[0086] 4.油脂的提取方法
[0087]培养至平台期的微藻，离心收集藻细胞，80°C烘干至恒重后，按照以下方法提取总 月旨，称取总脂的重量，然后计算油脂的百分率。
[0088]用氯仿/甲醇萃取的方法提取油脂。6000rpm离心10min收集藻细胞;弃上清，加入 lmL的1:1的氯仿/甲醇，祸旋振荡l-2min;加入0.3mL的lmol/L的KC1+0.2mol/L的磷酸混合 液，振荡，使相位分离;6000rpm离心10min，取下层氯仿相至称量瓶中；置于通风橱中吹干溶 剂，称取油脂的重量。
[0090] 在1 /4N浓度的BG11培养基中，细胞内油脂积累增高，高达27 %，显著高于BG11培养 基，因此1/4N BG11培养基大量培养斜生栅藻可用于油脂的提取，制备生物柴油，同时减少N 的使用，节约成本，减少对水体的污染。
[0091] 实施例4
[0092] 本实施例为所述斜生栅藻藻株S〇HNCJ2的规模化培养方法及其用于动物饲料多不 饱和脂肪酸添加应用。
[0093] 配置1/4N、3N、3P浓度和正常的BG11液体培养基，每500mL三角瓶中装入300nL培养 基。藻种培养至对数生长期后，离心收集洗涤一次后，接种于不同N、P浓度的培养基中，培养 至平台期后收集藻细胞，冷冻干燥用于脂肪酸成分分析 [0094]脂肪酸成分分析
[0095]油脂提取:收集藻体至10mL离心管中。加入3mL提取液(氯仿：甲醇= 2:1，含0.5mg/ mL 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酸），试管轻柔振荡过夜。5000rpm离心5min，分离开细胞碎片和 油脂提取液。细胞碎片再次用3mL提取液浸泡，试管轻柔振荡过夜，再次分离细胞碎片和油 脂提取液。合并两次的提取液即提取的油脂，用氮气吹干，4°C保存至分析时使用。
[0096]脂肪酸甲酯化及检测：
[0097]脂肪酸的甲酯化反应采用硫酸一甲醇加热法进行。脂肪酸的检测采用气相色谱 法，检测系统:Agilent 7890A型气相色谱仪，FID检测器;色谱柱：
[0098] HP-5弹性石英(30m X 0.32mm)。程序升温:初温210 °C，保持9min，20 °C/min升温，升 温240 °C，保持13min。内标法定量，内标物为二十二烧酸。
[0099]脂肪酸分析结果如下表所示：
[0101] 脂肪酸成分分析结果显示在不同的N、P浓度培养条件下，多不饱和脂肪酸十八碳 二烯酸和三烯酸含量较高，能够直接添加到动物饲料中，以提高动物饲料中的不饱和脂肪 酸含量。
[0102] 实施例5
[0103]所述斜生栅藻藻株SOHNCJ2的培养方法在有机污染污水处理中的应用。
[0104] 配置3N和3P浓度和正常的BG11液体培养基，每500mL三角瓶中装入300nL培养基。 藻种培养至对数生长期后，离心收集洗涤一次后，接种于高N、P浓度的培养基中，调整初始 0D值为0.05左右，然后放置于30°C、20001u X的条件下培养，每天摇动两次，每隔三天测定 0D73Q吸光值。
[0105]如图5所示:斜生栅藻在高浓度的N、P中的生长速率与BG11培养基中速率基本一致 在生长后期，在高对农度培养基中的生长速率甚至略高于普通BG11培养基，说明斜生藻能够 耐受有机污水中的高N、P浓度。此外，如下表所示高N、P浓度对藻细胞内油脂含量没有显著 的影响。
[0107]因此在培养过程中添加一定比例的有机污水，既节约了成本，净化了水体。收集的 细胞又可用于油脂提取，转脂化生产生物柴油。
【主权项】
1. 一株斜生栅藻藻株S0HNCJ2,其保藏编号为CCTCC N0:M2016253,保藏日期为2016年 5月6日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。2. -种如权利要求1所述的斜生栅藻藻株S〇HNCJ2的分离纯化方法，其特征在于： 1) 将采集的水样稀释后均匀涂布在1.5-2%琼脂的BG11培养基平板上，放置在培养箱中 进行连续光照培养； 2) 待平板上长出单藻落后，用牙签挑取单藻落在BG11平板上划短线培养； 3) 再将所得划短线培养的藻种用接种针划Z型线进行藻种的分离和除菌，然后用稀释 涂平板的方法进一步纯化藻种； 4) 挑取单藻落划短线和挑取短线藻落划Z线交替进行2~4次后得到纯净的单一藻落； 所述培养基采用淡水蓝藻培养基BG11。3. -种如权利要求1所述的斜生栅藻的培养方法，其特征在于:将淡水蓝藻培养基BG11 的N浓度降低到原来的1/4,即采用1/4 N浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量 如下： NaN03,0.375g K2HP〇4,0.04g MgS〇4.7H20,0.075g CaCl2.7H20,0.036g Na2C〇3,0.02g 梓檬酸，〇.〇〇6g 柠檬酸铁，〇.〇〇6g 微量元素溶液，A5 1 mL 采用蒸馏水定容至1000 mL。4. 一种如权利要求1所述的斜生栅藻的培养方法，其特征在于:将淡水蓝藻培养基BG11 的N浓度增加到原来的三倍，即采用3咐农度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如 下： NaN〇3,4.5g K2HP〇4,0.04g MgS(V7H2〇,0.075g CaCl2.7H20,0.036g Na2C〇3,0.02g 梓檬酸，〇.〇〇6g 柠檬酸铁，〇.〇〇6g 微量元素溶液，A5 1 mL 采用蒸馏水定容至1000 mL。5. -种如权利要求1所述的斜生栅藻的培养方法，其特征在于:将淡水蓝藻培养基BG11 的P浓度增加到原来的三倍，即采用3P浓度的BG11培养基，所述BG11培养基的成分及用量如 下： NaN〇3，1 · 5g K2HP〇4,0.12g MgS(V7H2〇,0.075g CaCl2.7H20,0.036g Na2C〇3,0.02g 梓檬酸，〇.〇〇6g 柠檬酸铁，〇.〇〇6g 微量元素溶液，A5 1 mL 采用蒸馏水定容至1000 mL。6. 根据权利要求3、4或5所述的斜生栅藻的培养方法，其特征在于:使藻株在温度15~ 40°C，光强500~2500 lux，pH7-9的条件下生长，培养至对数生长后期，藻细胞在6~12h内 完全自然沉降，倒出上层的培养基，即得到高浓度的藻液。7. 根据权利要求6所述的斜生栅藻的培养方法，其特征在于:培养温度为30°C，光强为 20001ux〇8. 所述的斜生栅藻藻株S〇HNCJ2，其在1/4N BG11培养基中大量培养，生长不受影响，油 脂含量最高，获得的含油藻细胞在转脂化生产生物柴油中的应用。9. 所述的斜生栅藻藻株S〇HNCJ2,其大量培养获得的斜生栅藻S〇HNCJ2的多不饱和脂肪 酸含量较高，用于动物饲料的添加。10. 所述的斜生栅藻藻株S〇HNCJ2,其在3N和3P培养基中生长不受影响，其培养方法在 有机污染污水处理中的应用。
【文档编号】C12P7/64GK105969667SQ201610502815
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】王赟, 柯飞, 王红强, 屈二军, 梁峰, 杨雨彬
【申请人】河南城建学院, 王赟