本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种制备莱菔素的方法。
二、
背景技术：
十字花科植物含有硫代葡萄糖苷(简称硫苷)，现代研究发现，在硫代葡萄糖苷酶(黑芥子酶)的催化下，硫代葡萄糖苷水解、重排，生成氰酸酯、异硫氰酸酯、腈类或恶唑烷等化合物。萝卜硫素是一种异硫氰酸酯，具有抗肿瘤、解毒抗菌、抗氧化的作用，对肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前胃癌有明显的阻断作用等，是一种具有市场潜力和经济价值的天然活性物。
现有分离萝卜硫素的方法有：刊登于《食品与发酵工程》2011年第37卷第7期，题目为“SP850树脂分离萝卜硫素”的论文，该论文公开的方法是：将西兰花种子粉碎，酶解18h后过滤得到萝卜硫素溶液，再将萝卜硫素溶液pH调节到3使蛋白质失活，过滤得到萝卜硫素上柱液，最后分别进行SP850树脂的静态和动态吸附，得到纯度为88.7％的萝卜硫素；申请号为201410321758.5，名称为“一种利用溶剂萃取法和分子蒸馏法联合制备萝卜硫素的方法”的发明专利，该专利公开的方法是：利用有机溶剂从萝卜硫素水解液中萃取并减压蒸馏得到萝卜硫素粗提物，再利用分子蒸馏分离纯化技术得到高纯度的萝卜硫素产品。上述两种方法存在的主要问题是：①选用二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂萃取萝卜硫素，此类溶剂易挥发或水溶性高，难以完全回收，污染环境；②用选择性低的大孔吸附树脂吸附目标物，难以获得专一性吸附，加之吸附分离时间长达数小时，而萝卜硫素在水溶液中30分钟即开始重排或异构化萝卜硫氰或异噁烷等杂质，因此，后续分离纯化的难度大且效率低，难以获得高纯度萝卜硫素。
三、
技术实现要素：
本发明是针对现有萝卜硫素分离提纯技术的不足之处，提供一种制备莱菔素的方法。该方法具有操作简单、高效、连续性强、溶剂可反复回收利用，产品纯度高且稳定等特点。
本发明的原理是：莱菔素的结构与萝卜硫氰或异噁烷等显著不同，与C18色谱柱的结合力不同，在特定流动相的洗脱下，流出色谱柱的时间出现差异，因此可以用高效液相色谱进行分离纯化。莱菔素的异硫氰酸根中的碳原子电子云密度低，可与富电子云的磷氧键氧原子形成配位键，因而能被例如磷酸三丁酯或三烷基氧化膦等萃取剂萃取；莱菔素溶于水和二氯甲烷，而二氯甲烷和水互不相溶，因此，用二氯甲烷可将莱菔素萃取并与水分离。莱菔素沸点高达200℃以上，二氯甲烷的沸点仅为40℃，而在真空条件下，其沸点更低，因此，控制体系的真空度，可在较低温度下完全蒸发该溶剂，最终获得莱菔素产品。
本发明的目的是通过以下途径实现的，一种制备莱菔素的方法，以脱脂胭脂萝卜籽粉为原料，经过制备萝卜硫苷水解液、制备莱菔素粗分离液、配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液、制备莱菔素初步纯化液、制备纯化莱菔素浓缩液及制备莱菔素的步骤，快速制备出纯度超过99％的莱菔素。其具体的工艺步骤如下：
(1)制备萝卜硫苷水解液
现有制备莱菔素的技术，按照专利号为201510270292.5介绍的方法制备出萝卜硫苷水解液，用于下步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
将萝卜硫苷水解液泵入管式离心机中，以0.5～1.5×104r/min的转速进行离心分离，分别收集离心清液和离心沉淀。对收集的离心沉淀，为莱菔子分离蛋白，用于加工食品添加剂；对收集的离心清液，泵入截留分子量为0.5～1×104Da的超滤机中，在表压为0.02～0.2MPa下进行超滤，直至超滤截留液为滤过液的1/8～1/10时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，主要含有多糖，用于加工莱菔子多糖；对收集的超滤滤过液，泵入截留分子量为200～500Da的纳滤机中，在表压为0.1～0.5MPa下进行纳滤，直至纳滤截留液为滤过液的1/8～1/10时止。分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤截留液，主要含小分子肽，用于加工饲料添加剂；对收集的纳滤滤过液，即为莱菔素粗分离液，用于制备莱菔素初步纯化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
将磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在搅拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出浓度为0.05～0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取莱菔素粗分离液中的莱菔素。
(4)制备莱菔素初步纯化液
第(3)步结束后，将第(2)步收集的莱菔素粗分离液泵入萃取釜中，按照莱菔素粗分离液/浓度为0.05～0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的体积比(L/L)为1∶1～3的比例，与TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在40～80r/min的转速下萃取5～20min，然后静止5～10min分层。分别收集上层荷载莱菔素的萃取液和下层卸载莱菔素的萃余液，对收集的下层卸载莱菔素的萃余液，泵入生化处理池，进行生物氧化，达标后排放；对收集的上层荷载莱菔素的萃取液，加入0.05～0.2mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液进行反萃取5～20min，然后静止5～10min分层，其中萃取液与浓度0.05～0.2mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液的体积比为1∶1～3。分别收集含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液和卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，对收集的含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液，即为莱菔素初步纯化液，用于下步制备纯化莱菔素浓缩液；对收集的卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.5～0.8×104r/min的转速下离心5～10min。弃离心下层盐溶液；收集离心上层清液，即获得浓度为0.05～0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，该再生萃取液可用于下批次再次萃取莱菔素。
(5)制备纯化莱菔素浓缩液
将第(4)步收集的莱菔素初步纯化液用0.22～0.45μm微孔滤膜过滤后泵入制备色谱，进行第一次制备。制备条件为：流速20～40mL/min、波长254nm、柱温25℃，在0～30min期间，甲醇/水体积比(L/L)为10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液体，将其在真空度为0.06～0.09MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。即为纯化莱菔素浓缩液，用于下步制备莱菔素。
(6)制备莱菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的纯化莱菔素浓缩液中加入二氯甲烷进行萃取5～10min，纯化莱菔素浓缩液/二氯甲烷体积比(L/L)为1∶1～3。萃取完成后静止5～10min分层。分别收集上层萃取相和下层萃余液，对收集的萃取相，泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为30～45℃、真空度为0.4～40kPa的条件下回收二氯甲烷，直至无二氯甲烷时止。就制备出纯度达到99.14％的莱菔素，其收得率为脱脂莱菔子质量的0.35～0.5％。对收集的萃余液，泵入生化池进行好氧氧化，达标后排放。
本发明采用了上述技术手段后主要产生了以下效果：
1、本发明方法在生产过程中使用超滤、纳滤分离，萃取、制备色谱及高压低温浓缩等现代化工技术和设备，具有操作简便，分离精准，条件温和，节约能源，生产成本低等特点；
2、本发明采用TBP或TRPO磺化煤油萃取液萃取、分离莱菔素粗分离液中的莱菔素，具有分离效果明显，操作简便，萃取剂可回收利用等优点；
3、本发明采用二氯甲烷萃取莱菔素浓缩液，快速脱除莱菔素中的水，使莱菔素更加稳定，且二氯甲烷沸点低，在高真空下快速蒸发回收，进而获得纯度达到99.14％、产率为脱脂莱菔子质量0.35～0.5％的莱菔素产品；
4、本发明使用制备型液相色谱分离莱菔素，制备色谱的塔板数极高，分离精准，其流动相经处理后可回用，显著降低了溶剂消耗；
5、本发明生产过程中产生的副产物，均得到有效利用，无“三废”产生，是典型的绿色生产工艺，便于推广应用。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
(1)制备萝卜硫苷水解液
现有制备莱菔素的技术，按照专利号为201510270292.5介绍的方法制备出萝卜硫苷水解液，用于下步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
将萝卜硫苷水解液泵入管式离心机中，以0.5×104r/min的转速进行离心分离，分别收集离心清液和离心沉淀。对收集的离心沉淀，为莱菔子分离蛋白，用于加工食品添加剂；对收集的离心清液，泵入截留分子量为0.5×104Da的超滤机中，在表压为0.02MPa下进行超滤，直至超滤截留液为滤过液的1/8时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，主要含有多糖，用于加工莱菔子多糖；对收集的超滤滤过液，泵入截留分子量为200Da的纳滤机中，在表压为0.1MPa下进行纳滤，直至纳滤截留液为滤过液的1/8时止。分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤截留液，主要含小分子肽，用于加工饲料添加剂；对收集的纳滤滤过液，即为莱菔素粗分离液，用于制备莱菔素初步纯化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
将磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在搅拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出浓度为0.05mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取莱菔素粗分离液中的莱菔素。
(4)制备莱菔素初步纯化液
第(3)步结束后，将第(2)步收集的莱菔素粗分离液泵入萃取釜中，按照莱菔素粗分离液/浓度为0.05mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的体积比(L/L)为1∶1的比例，与TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在40r/min的转速下萃取5min，然后静止5min分层。分别收集上层荷载莱菔素的萃取液和下层卸载莱菔素的萃余液，对收集的下层卸载莱菔素的萃余液，泵入生化处理池，进行生物氧化，达标后排放；对收集的上层荷载莱菔素的萃取液，加入0.05mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液进行反萃取5min，然后静止5min分层，其中萃取液与浓度0.05mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液的体积比为1∶1。分别收集含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液和卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，对收集的含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液，即为莱菔素初步纯化液，用于下步制备纯化莱菔素浓缩液；对收集的卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.5×104r/min的转速下离心5min。弃离心下层盐溶液；收集离心上层清液，即获得浓度为0.05mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，该再生萃取液可用于下批次再次萃取莱菔素。
(5)制备纯化莱菔素浓缩液
将第(4)步收集的莱菔素初步纯化液用0.22μm微孔滤膜过滤后泵入制备色谱，进行第一次制备。制备条件为：流速20mL/min、波长254nm、柱温25℃，在0～30min期间，甲醇/水体积比(L/L)为10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液体，将其在真空度为0.06MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。即为纯化莱菔素浓缩液，用于下步制备莱菔素。
(6)制备莱菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的纯化莱菔素浓缩液中加入二氯甲烷进行萃取5min，纯化莱菔素浓缩液/二氯甲烷体积比(L/L)为1∶1。萃取完成后静止5min分层。分别收集上层萃取相和下层萃余液，对收集的萃取相，泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为30℃、真空度为0.4kPa的条件下回收二氯甲烷，直至无二氯甲烷时止。就制备出纯度达到99.14％的莱菔素，其收得率为脱脂莱菔子质量的0.35～0.5％。对收集的萃余液，泵入生化池进行好氧氧化，达标后排放。
实施例2
(1)制备萝卜硫苷水解液
现有制备莱菔素的技术，按照专利号为201510270292.5介绍的方法制备出萝卜硫苷水解液，用于下步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
将萝卜硫苷水解液泵入管式离心机中，以1.0×104r/min的转速进行离心分离，分别收集离心清液和离心沉淀。对收集的离心沉淀，为莱菔子分离蛋白，用于加工食品添加剂；对收集的离心清液，泵入截留分子量为0.75×104Da的超滤机中，在表压为0.1MPa下进行超滤，直至超滤截留液为滤过液的1/9时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，主要含有多糖，用于加工莱菔子多糖；对收集的超滤滤过液，泵入截留分子量为300Da的纳滤机中，在表压为0.3MPa下进行纳滤，直至纳滤截留液为滤过液的1/9时止。分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤截留液，主要含小分子肽，用于加工饲料添加剂；对收集的纳滤滤过液，即为莱菔素粗分离液，用于制备莱菔素初步纯化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
将磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在搅拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出浓度为0.10mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取莱菔素粗分离液中的莱菔素。
(4)制备莱菔素初步纯化液
第(3)步结束后，将第(2)步收集的莱菔素粗分离液泵入萃取釜中，按照莱菔素粗分离液/浓度为0.10mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的体积比(L/L)为1∶2的比例，与TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在60r/min的转速下萃取12min，然后静止8min分层。分别收集上层荷载莱菔素的萃取液和下层卸载莱菔素的萃余液，对收集的下层卸载莱菔素的萃余液，泵入生化处理池，进行生物氧化，达标后排放；对收集的上层荷载莱菔素的萃取液，加入0.12mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液进行反萃取12min，然后静止8min分层，其中萃取液与浓度0.12mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液的体积比为1∶2。分别收集含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液和卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，对收集的含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液，即为莱菔素初步纯化液，用于下步制备纯化莱菔素浓缩液；对收集的卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.6×104r/min的转速下离心8min。弃离心下层盐溶液；收集离心上层清液，即获得浓度为0.10mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，该再生萃取液可用于下批次再次萃取莱菔素。
(5)制备纯化莱菔素浓缩液
将第(4)步收集的莱菔素初步纯化液用0.22μm微孔滤膜过滤后泵入制备色谱，进行第一次制备。制备条件为：流速30mL/min、波长254nm、柱温25℃，在0～30min期间，甲醇/水体积比(L/L)为10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液体，将其在真空度为0.08MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。即为纯化莱菔素浓缩液，用于下步制备莱菔素。
(6)制备莱菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的纯化莱菔素浓缩液中加入二氯甲烷进行萃取8min，纯化莱菔素浓缩液/二氯甲烷体积比(L/L)为1∶2。萃取完成后静止8min分层。分别收集上层萃取相和下层萃余液，对收集的萃取相，泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为38℃、真空度为20kPa的条件下回收二氯甲烷，直至无二氯甲烷时止。就制备出纯度达到99.14％的莱菔素，其收得率为脱脂莱菔子质量的0.35～0.5％。对收集的萃余液，泵入生化池进行好氧氧化，达标后排放。
实施例3
(1)制备萝卜硫苷水解液
现有制备莱菔素的技术，按照专利号为201510270292.5介绍的方法制备出萝卜硫苷水解液，用于下步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
将萝卜硫苷水解液泵入管式离心机中，以1.5×104r/min的转速进行离心分离，分别收集离心清液和离心沉淀。对收集的离心沉淀，为莱菔子分离蛋白，用于加工食品添加剂；对收集的离心清液，泵入截留分子量为1×104Da的超滤机中，在表压为0.2MPa下进行超滤，直至超滤截留液为滤过液的1/10时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，主要含有多糖，用于加工莱菔子多糖；对收集的超滤滤过液，泵入截留分子量为500Da的纳滤机中，在表压为0.5MPa下进行纳滤，直至纳滤截留液为滤过液的1/10时止。分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤截留液，主要含小分子肽，用于加工饲料添加剂；对收集的纳滤滤过液，即为莱菔素粗分离液，用于制备莱菔素初步纯化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
将磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在搅拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出浓度为0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取莱菔素粗分离液中的莱菔素。
(4)制备莱菔素初步纯化液
第(3)步结束后，将第(2)步收集的莱菔素粗分离液泵入萃取釜中，按照莱菔素粗分离液/浓度为0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的体积比(L/L)为1∶3的比例，与TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在80r/min的转速下萃取20min，然后静止10min分层。分别收集上层荷载莱菔素的萃取液和下层卸载莱菔素的萃余液，对收集的下层卸载莱菔素的萃余液，泵入生化处理池，进行生物氧化，达标后排放；对收集的上层荷载莱菔素的萃取液，加入0.2mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液进行反萃取20min，然后静止10min分层，其中萃取液与浓度0.2mol/L的氯化钠溶液或氯化钾溶液的体积比为1∶3。分别收集含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液和卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，对收集的含莱菔素的氯化钠或氯化钾反萃取液，即为莱菔素初步纯化液，用于下步制备纯化莱菔素浓缩液；对收集的卸载莱菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.8×104r/min的转速下离心10min。弃离心下层盐溶液；收集离心上层清液，即获得浓度为0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，该再生萃取液可用于下批次再次萃取莱菔素。
(5)制备纯化莱菔素浓缩液
将第(4)步收集的莱菔素初步纯化液用0.45μm微孔滤膜过滤后泵入制备色谱，进行第一次制备。制备条件为：流速40mL/min、波长254nm、柱温25℃，在0～30min期间，甲醇/水体积比(L/L)为10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液体，将其在真空度为0.09MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。即为纯化莱菔素浓缩液，用于下步制备莱菔素。
(6)制备莱菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的纯化莱菔素浓缩液中加入二氯甲烷进行萃取10min，纯化莱菔素浓缩液/二氯甲烷体积比(L/L)为1∶3。萃取完成后静止10min分层。分别收集上层萃取相和下层萃余液，对收集的萃取相，泵入低温高真空溶剂回收装置，在温度为45℃、真空度为40kPa的条件下回收二氯甲烷，直至无二氯甲烷时止。就制备出纯度达到99.14％的莱菔素，其收得率为脱脂莱菔子质量的0.35～0.5％。对收集的萃余液，泵入生化池进行好氧氧化，达标后排放。